增强记忆的元宝枫籽油DHA凝胶糖果及机制研究

古敏晴 ，李楚洁 ，李飞飞 ，肖盼盼 ，王新文, ，李文保

1.深圳市华大海洋生物医药技术研究院（深圳 518000）；2.深圳华泓海洋生物医药有限公司（深圳 518000）；3.深圳华大海洋科技有限公司（深圳 518000）

酒精滥用和酒精依赖严重影响人类健康和生活。全球每年因酒精死亡的人数有330多万人[1]。研究发现酒精能够造成中枢神经系统损伤，从而导致神经认知障碍、学习和记忆损伤[2]。酒精引起的这些症状与神经炎症有关[3-4]，可能是通过Toll样受体-4（TLR-4）激活小胶质细胞，促进核因子kappa-κB（NF-κB）和白细胞介素-1β（IL-1β）[5-6]。因此，通过开发一款具有抗神经炎症的安全有效的食源性功能产品，对患者进行营养干预，以改善记忆，具有重要的现实意义。

元宝枫为槭树科的落叶乔木，元宝枫籽油的神经酸含量在5%以上[7]，是一种新资源食品。神经酸是一种促进神经细胞生长、再生和维持所需的高级营养物质[8-9]。元宝枫籽油是神经酸的主要商业来源[10]。二十二碳六烯酸（DHA）是在海产品，如深海鱼油、藻油中发现的最重要的n-3 PUFA之一；DHA缺乏与中枢神经系统功能障碍的风险之间也存在联系，如焦虑[11]、学习障碍[12]和认知障碍[13]。酸枣仁提取物广泛应用于中药，已被证明对治疗失眠、睡眠问题、焦虑和神经衰弱有效[14]。

试验以元宝枫籽油、DHA、酸枣仁提取物为原材料，利用体内外试验研究三者不同配方对脑损伤和记忆障碍的改善作用，从而明确主要功效成分及最佳配方，并探究其潜在作用机理，为预防和治疗酒精诱导的脑损伤和记忆障碍提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

元宝枫籽油（西安百川生物科技有限公司）；DHA（广州欣和健康科技有限公司）；酸枣仁提取物（南京郎泽生物科技有限公司）；玉米油（金龙鱼牌）；竞品1和竞品2（购自京东）；乙醇（深圳市化试科技有限公司）；小鼠TNF-α、IL-1β酶联免疫分析试剂盒（北京冬歌博业生物科技有限公司）；iba-1抗体（北京索莱宝科技有限公司）；异氟烷（江苏恒丰强生物技术有限公司）。

1.2 仪器与设备

水迷宫仪器（XR-XM101，上海欣软信息科技有限公司）；全波长酶标仪（Epoch+Elx508，美国伯腾仪器有限公司）；立式光学显微镜（DS-U3，尼康株式会社）；便携式多道小动物麻醉机（ZS-MV-IV，北京众实迪创科技发展有限责任公司）。

1.3 试验动物

ICR雄性小鼠136只（辽宁长生生物技术股份有限公司）。SPF级动物房，每笼饲养小鼠4只，温度24±2 ℃，湿度50%±10%，12 h光照-黑暗循环，自由摄食和饮水。

1.4 试验方法

1.4.1 主原料及原料配比筛选

1.4.1.1 主原料的提升记忆力效果

雄鼠适应期结束后，按照体重随机分为5组，分别是正常对照组、模型对照组、元宝枫籽油组、DHA组、酸枣仁提取物组。灌胃给药3周后，开始制造记忆再现障碍模型：重测验前30 min灌胃30%的乙醇10 mL/（kg·bw）。使用水迷宫试验测试记忆能力。

1.4.1.2 不同配方的提升记忆力效果

雄鼠适应期结束后，按照体重随机分为7组，具体分组见表1。给药3周后，开始制造记忆再现障碍模型：重测验前30 min灌胃30%的乙醇10 mL/（kg·bw）。使用水迷宫试验测试记忆能力。

表1 动物试验方案

1.4.1.3 最优配方与竞品的提升记忆力效果的对比

雄鼠适应期结束后，按照体重随机分为5组，分别是正常对照组、模型对照组、最优配方组、竞品1组、竞品2组。灌胃给药3周后，开始制造记忆再现障碍模型：重测验前30 min灌胃30%的乙醇10 mL/（kg·bw）。使用水迷宫试验测试记忆能力。

1.4.1.4 水迷宫检测

方法参考文献[15]。试验水迷宫为直径120 cm、高度50 cm的圆柱形装置，平台为直径12 cm的圆形平台，水温23~25 ℃，平台在东北象限（NE），并低于水平面1 cm。每次将小鼠头朝池壁放入水迷宫中，随机放入不同位置。每次训练限定在60 s内，若没有超过60 s，记录动物找到水下平台的时间，为潜伏期；若超过60 s，时间则记录为60 s。每只动物每天训练4次，两次训练之间间隔30~40 min，共训练5 d。

1.4.2 最优配方改善记忆的机制研究

1.4.2.1 脑切片苏木精-伊红（H-E）染色

试验第28天，异氟烷过量麻醉后牺牲小鼠，取全脑，用4%多聚甲醛固定至少24 h，并用石蜡包埋、切片（4 μm），用H-E染色。使用显微镜观察脑切片，用CASEVIEWER全景扫描软件拍照。

1.4.2.2 脑组织TNF-α和IL-β含量测定

使用酶联免疫吸附试验试剂盒检测脑组织中TNF-α和IL-β的水平。所有的检测均按照制造商的说明书进行。

1.4.2.3 脑切片免疫荧光染色

iba-1是小胶质细胞标志物，其荧光强度可以显示小胶质细胞的激活情况。石蜡切片与小鼠iba-1抗体孵育。染色切片用显微镜观察，并用CASEVIEWER全景扫描软件拍照。

1.4.3 营养及质量检测

按照GB 17399——2016《食品安全国家标准 糖果》、SB/T 10021——2017《糖果 凝胶糖果》及GB 2762——2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量》的要求，对产品进行营养及质量检测。

1.4.4 数据处理

采用SPSS 18.0软件进行数据统计分析，采用双尾t-检验，其中P≤0.05表示差异性显著。使用GraphPad Prism 7软件作图。

2 结果与分析

2.1 主原料及原料配比筛选

2.1.1 主原料的提升记忆力效果

水迷宫检测指标中，潜伏期越短，则说明其记忆力越好。如图1所示，与正常对照组比较，模型对照组小鼠第2~第5天学习记忆训练潜伏期显著延长，而元宝枫籽油、DHA和酸枣仁提取物组小鼠第4~第5天记忆训练潜伏期显著短于模型对照组。说明这3种主原料均有提升记忆力的效果，且元宝枫籽油效果相对较好，故选择元宝枫籽油为必备功效成分，复配DHA和（或）酸枣仁提取物，以确定产品功效成分及最佳配比。

图1 元宝枫籽油、DHA和酸枣仁提取物3种主原料对乙醇致小鼠记忆再现障碍的影响

2.1.2 不同配方的提升记忆力效果

如图2所示，与正常对照组比较，模型对照组小鼠于第1，第3~第5天学习记忆训练潜伏期显著延长，而配方3组小鼠于第1，第3和第5天记忆训练潜伏期显著短于模型对照组，配方5组小鼠于第1，第3和第4天记忆训练潜伏期显著短于模型对照组，其余配方效果一般。结果表明配方3和配方5均有提升记忆力的效果，且配方3效果相对更好。

图2 各配方组对乙醇致小鼠记忆再现障碍的影响

2.1.3 最优配方与竞品的提升记忆力效果的对比

分析图3，从第2天开始到第5天训练期，与正常对照组比较，模型对照组小鼠学习记忆训练潜伏期显著延长。与模型对照组相比，配方3组小鼠学习记忆训练潜伏期显著缩短。竞品1组和竞品2组小鼠学习记忆训练潜伏期并没有显著缩短。并且，在第2和第3天训练期，配方3组小鼠记忆训练潜伏期显著短于竞品1组小鼠记忆训练潜伏期。说明研发的配方3产品与市售产品相比，在辅助改善记忆力的作用显著。

图3 配方3与2款竞品对乙醇致小鼠记忆再现障碍的影响

2.2 最优配方改善记忆的机制研究

2.2.1 脑切片H-E染色

如图4所示，在正常对照组中，海马CA3区锥体细胞排列紧密，未见细胞丢失。且细胞呈圆形且完整，细胞核染色明显，呈深蓝色。相反，模型对照组海马区有明显的损伤，CA3区部分神经元丢失，神经元核固缩，呈深嗜碱性。这些异常情况可通过灌胃配方3而得到改善。综上所述，配方3可以保护大脑免受酒精损伤。

图4 配方3组对海马CA3区和大脑皮层区的影响

2.2.2 脑组织TNF-α和IL-1β含量测定

与正常对照组相比，模型对照组小鼠脑组织中促炎细胞因子如TNF-α和IL-1β的水平显著升高。但与模型对照组小鼠相比，配方3可显著降低TNF-α和IL-1β水平（图5），说明配方3可降低脑内炎症。

图5 配方3对小鼠脑内TNF-α和IL-1β水平的影响

2.2.3 脑切片免疫荧光染色

iba-1是脑内小胶质细胞标记物，若小胶质细胞被激活，则提示大脑出现炎症反应[16]。如图6所示，乙醇可增加大脑中iba-1阳性小胶质细胞的数量，而配方3可以减少脑中iba-1阳性小胶质细胞，提示该配方可能通过抑制脑内小胶质细胞的激活，从而减少脑内炎症。

图6 配方3组对小胶质细胞的影响

2.3 产品营养及质量检测

对研发的元宝枫籽油DHA复合凝胶糖果进行营养及质量检测，结果显示（表2），研发的产品具有品种该有的色泽、形态、组织，无外来杂质，且微生物指标及理化指标均符合国家相关标准要求，是一款安全的天然功能产品。

表2 产品检测结果

3 结论

试验以元宝枫籽油、DHA、酸枣仁提取物为主要原料，研制一款具有增强记忆力功能的凝胶糖果，且功效优于市场流通较好的2个竞品，具有开发应用价值，有望成为因酒精导致记忆力下降和有提高记忆力需求的人群的一种安全无后顾之忧的新选择。产品可通过抑制小胶质细胞活性和减少炎症细胞因子的释放，从而提高记忆和学习能力，保护大脑免受酒精损伤和记忆障碍。此配方下研制的产品具有品种该有的色泽、形态、组织，无外来杂质，且各项指标均符合国家标准。