GK糖尿病大鼠感染创面的生物学特性研究

金达康 谢仕源 梁瑶 王柳萍 杨斌*

糖尿病患者的并发症有糖尿病肾病、糖尿病周围神经病和糖尿病大血管病变等，而最严重的主要是糖尿病足［1-2］。在发生足部溃疡的糖尿病患者中有超过50%会出现感染，而合并感染后的截肢率是未合并感染者的50-150 倍［3］。因此，对糖尿病足合并感染伤口的研究至关重要，而动物模型的构建是疾病研究的重要方法。Goto-Kakizaki（GK）大鼠属于非胰岛素依赖非肥胖自发Ⅱ糖尿病大鼠模型［4］。但对GK 大鼠在建立糖尿病足合并感染模型方面的研究鲜有报道。故本研究拟采用GK 大鼠和Wistar 大鼠为研究对象，建立糖尿病感染创面模型，观察糖尿病大鼠感染创面的生物学特性，为GK 大鼠应用于糖尿病足合并感染的治疗研究提供实验依据。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物雄性SPF 级GK 大鼠12 只，20-22周龄，从常州文斯实验动物有限公司（动物生产许可证号：SCXK（苏）2016-0010）购进，雄性SPF 级Wistar 大鼠12 只，20-22 周龄，从北京维通利华实验动物技术有限公司（动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0006）购进。购回的动物饲养在广西医科大学实验动物中心，动物使用许可证号为SYXK桂2020-0004。动物实验方案经广西医科大学动物伦理委员会审核批准，符合动物伦理要求。

1.2 实验材料PCT 和hs-CRP 试剂盒购自上海科兴商贸有限公司；金黄色葡萄球菌购自广西省微生物菌种保藏中心；高脂高糖饲料购自南京盛民科研动物养殖场；α-SMA 和CD31 抗体购自武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 糖尿病大鼠感染创面模型的建立 动物的准备：高脂高糖饲料饲养GK 大鼠和Wistar 大鼠14 天后，随机选取非空腹时血糖大于或等于11.1 mmol/L 的10 只GK 大鼠备用，同时取10 只Wistar 大鼠备用。菌种的准备：将金黄色葡萄球菌混悬液浓度调整至1-2×106CFU/mL，置于冰箱中待用。全皮层创面的制作及接种细菌：麻醉大鼠后退去背部毛发并消毒，切除大鼠背部边长为2 cm 的正方形皮肤，放置标尺拍照。将40 μl 金黄色葡萄球菌悬液滴加于创面，覆盖四层无菌纱布（边长为2 cm 的正方形）后，贴上3M 透明敷料，外层以绷带环绕动物身体包扎并用胶带固定。

1.3.2 动物分组及创面护理 动物分组：造模后，随机选取在D0 天创面金黄色葡萄球培养菌落数均大于1×105CFU 的GK 大鼠和Wistar 大鼠各8 只，GK 大鼠设为模型组，Wistar 大鼠设为正常组。创面护理：以动物开创时为第-1 天（D-1），创面感染细菌第一天后为第0 天（D0），护理第21 天（D21）为试验终点，在时间点D1、D2、D3、D5、D7、D11、D14、D17、D21 进行敷料更换护理。在D1、D3、D7、D14 和D21 时：将创面取下的敷料放入100 ml的D/E 中和肉汤用于细菌培养计数；并在创面放置标尺拍照。之后覆盖10 层无菌纱布（边长为2 cm 的正方形）后同上包扎固定。在D2、D5、D11、D17 时，除不进行创面敷料取菌培养外，其它同法操作。

1.3.3 敷料上细菌的培养计数 震荡装有敷料及肉汤的PE 塑料瓶（250 rpm/min）后，吸取1 ml 肉汤，按照平板法进行培养并记录菌落数目，计算敷料上的细菌，公式为：，其中B 为敷料细菌总数，CFU；C 为适宜梯度下平板的菌落平均数，CFU；D为稀释梯度。

1.3.4 创面愈合率的计算 使用ImageJ 软件测量出每只鼠在D1、D3、D5、D7、D11、D14、D17、D21 时的创面面积，计算出创面愈合率，公式为：X=(YZ)/Y×100%，其中，X 为创面愈合率，%；Y 为D1 创面面积，mm2；Z 为各时间点创面面积，mm2。

1.3.5 试验终点 在D22 天，麻醉大鼠，采集血液样本3000 r/min 离心10 min，取血清备用；大鼠安乐死后，剪取创面愈合处长为2 cm 的正方形皮肤，用4%多聚甲醛固定，进行组织病理学检测。

1.3.6 试剂盒测定 参照酶联免疫分析（ELISA）测定试剂盒说明书，测定大鼠血清中降钙素原（PCT）和超敏C-反应蛋白（hs-CRP）的水平。

1.3.7 HE 染色观察愈合创面组织形态学的改变皮肤组织蜡块的制备，切片脱蜡至水，进行常规HE 染色。

1.3.8 统计分析 数据采用SPSS 软件（21.0 版本）进行统计处理，以（x±s）表示，用单因素方差方法（ANOVA）进行分析，P＜0.05 表示有显著性差异。

2 结 果

2.1 大鼠感染创面的愈合情况见图1 和2。

图1 不同时间点大鼠感染创面的愈合率

图2 大鼠感染创面不同时间点的创面愈合情况

2.2 大鼠感染创面的纱布敷料菌落数情况见图3。

图3 大鼠感染创面不同时间点的纱布敷料菌落数

2.3 大鼠血清中PCT 和hs-CRP 水平见图4。

图4 大鼠血清中PCT、hs-CRP 水平比较

2.4 愈合创面病理组织学检查见图5。

图5 大鼠皮肤的HE 染色（比例尺=100 μm，100×）

3 讨 论

糖尿病足溃疡是糖尿病发展到中晚期的一种严重并发症，而出现严重感染后，将可能会导致截肢的不良后果［1-2］。创面愈合率是评价皮肤创面愈合的一个直观的指标［5］。在本课题中，相比于正常组，GK 大鼠感染创面在D3、D7、D11、D14、D17不同时间点的创面愈合率均显著减小。这提示与正常大鼠相比，GK 大鼠的创面较难愈合。

此外，感染是糖尿病足患者创面溃疡愈合难、导致截肢甚至死亡的最直接原因，控制创面感染对于糖尿病足的治疗至关重要［3］。为了观察GK大鼠创面的病原菌生长情况，本课题对大鼠皮肤创面敷料的细菌进行培养计数。结果表明，在D7时间点，模型组的敷料菌落数显著增加。提示GK大鼠感染创面的抗菌能力较低。

PCT 是一种细菌感染的敏感诊断指标，当感染细菌后，PCT 的浓度会迅速升高［6］。hs-CRP 在自身免疫疾病和持续性炎症中明显升高，是一种反映机体炎性状态的敏感指标［7］。本实验结果显示，相对于正常组，模型组PCT 和hs-CRP 显著增加，提示GK 大鼠感染创面存在炎症反应。

伤口愈合是一个复杂的过程，包括凝血、炎症、肉芽组织形成、上皮形成、胶原合成和组织重塑［8］。为了进一步了解创面部位组织的再生情况，本实验对创面组织进行HE 染色，以观察皮肤层的形态变化。实验结果显示，相比于正常组，模型组的新生表皮明显变薄，表皮向下凸出（表皮脊或表皮网）和相应的真皮层向上突起结构缺失，提示组织功能的恢复较差。

综上所述，GK 糖尿病大鼠感染创面模型具有一定的生物学特性，其特性包括创面愈合延缓，创面细菌生长增加，血液PCT 和hs-CRP 含量增加。本实验观察了GK 大鼠感染创面的部分生物学特点，以期为GK 大鼠应用于糖尿病足合并感染的治疗研究提供一些基本资料。