胃癌患者血清miR-369、miR-1323水平及其临床意义

杨思雨,姜淮芜,姚晖,周航宇,马波

胃癌已成为全球消化道恶性肿瘤之一,其在我国具有较高发病率和病死率[1]。目前诊断胃癌的金标准是以胃镜活检为主,此方法费用高,耐受性差,因此未成为大规模筛查胃癌的方法[2]。随着人们生活水平的提高和饮食结构的变化,胃癌患者呈现出年轻化的趋势,若不及时诊治将严重威胁患者生命健康。近年来,胃癌的诊治取得很大进展,但胃癌患者预后效果不佳,因此寻找能够准确评估患者预后的生物标志物对于胃癌患者预后意义重大[3]。微小RNA(microRNA,miRNA)属于短链非编码RNA分子,其与机体细胞分化、凋亡等多重生理功能相关,在不同的肿瘤疾病中有着不同的作用[4-5]。研究发现,miR-369-3p在甲状腺滤泡癌组织和肝癌组织中均表达下调,上调其表达可抑制癌细胞的增殖、生长和转移[6-7]。miR-1323与肺腺癌患者预后、肺炎支原体肺炎等肺部疾病相关[8-9]。本研究通过检测胃癌患者血清miR-369与miR-1323表达水平,分析二者与临床病理特征的关系及对患者预后的预测价值,旨在为胃癌患者预后评估提供新的生物靶标,报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年3月—2018年3月西南医科大学附属医院胃肠外科手术治疗的胃癌患者97例为病例组,男49例,女48例,年龄36～74(60.43±10.67)岁;体质量指数(BMI)20～25(22.36±1.97)kg/m2;另外选择同期医院健康体检者90例作为健康对照组,男44例,女46例,年龄32～76(60.89±8.35)岁;BMI 20～25(22.54±1.56)kg/m2。2组性别、年龄、BMI比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究经医院伦理委员会审核批准(1600139),受试者及家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准:①经病理学检查确定为胃癌[10];②首次进行胃癌切除手术;③胃癌患者均采用常规标准胃癌根治术治疗,术后根据患者病情进行辅助化疗措施;④临床资料完整。(2)排除标准:①合并其他恶性肿瘤者;②有严重心脏、肝脏、肾脏疾病者;③有严重免疫缺陷者;④临床资料不全者。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 血清miR-369与miR-1323水平检测:患者于入院后24 h内及健康对照组体检当日清晨抽取空腹肘静脉血5 ml,离心留取血清,置于-80℃冰箱中保存备用。使用TRIzol试剂(购自北京普非生物科技有限公司)提取胃癌患者血清中的总RNA,后进行反转录(M-MLV反转录试剂盒购自上海广锐生物科技有限公司),取反转录产物进行qRT-PCR反应(qRT-PCR仪购自美国Bio-Rad公司,型号 CFX384;荧光定量PCR试剂盒购自上海雅吉生物科技有限公司),qRT-PCR反应程序:94℃预变性5 min、95℃变性15 s、56℃退火30 s、62℃延伸30 s,共循环35次。分别以U6为内源对照,以2-ΔΔCt法计算miR-369与miR-1323表达水平。引物由上海生工生物工程有限公司合成,miR-369上游引物:5’-CTCCTGGTACCTGAA-GGGAGA-3’,下游引物:5’-CTCCAAGGTGACTGA-GATTTGAT-3’;miR-1323上游引物:5’-CTCGCTTCGGCAGCA-CA-3’,下游引物:5’-AACGCTTCGAATTTG-CGT-3’;U6上游引物:5’-ATTGGAACGATACAG-AGAAGATT-3’,下游引物:5’-GGAACGCTTCACGA-ATTTG-3’。

1.3.2 随访:采用到院复诊或电话等方式对胃癌患者术后进行随访,随访时间为3年,随访率100%,根据患者随访期间生存或者死亡情况,分为预后良好亚组59例和预后不良亚组38例。

2 结 果

2.1 2组血清miR-369与miR-1323水平比较 病例组血清miR-369表达显著低于健康对照组,血清miR-1323表达显著高于健康对照组 (P<0.01),见表1。

表1 健康对照组与病例组血清miR-369与miR-1323水平比较

2.2 不同预后亚组胃癌患者血清miR-369与miR-1323表达比较 预后不良亚组患者血清miR-369表达显著低于预后良好亚组,血清miR-1323表达显著高于预后良好亚组(P<0.01),见表2。

表2 预后良好亚组与预后不良亚组胃癌患者血清miR-369与miR-1323表达水平比较

2.3 血清miR-369、miR-1323表达在胃癌患者不同临床/病理特征中比较 血清miR-369、miR-1323表达在不同性别、年龄、基础病、家族遗传史、吸烟史、饮酒史等患者比较,差异无统计学意义(P>0.05),而在患者不同癌组织的分化程度、肿瘤直径、TNM分期、淋巴结转移、浸润深度方面比较,差异均有统计学意义(P<0.05),见表3。

2.4 血清miR-369与miR-1323预测胃癌患者预后的价值分析 绘制血清miR-369与miR-1323预测胃癌患者预后价值的ROC曲线,并计算曲线下面积(AUC),结果显示,血清miR-369、 miR-1323及二者联合预测胃癌患者预后的AUC为0.704、0.747、0.823,二者联合预测价值优于各自单独预测(Z/P=2.713/0.006,1.733/0.040),见表4、图1。

表3 血清miR-369与miR-1323表达在胃癌患者不同临床/病理特征中比较

表4 血清miR-369与miR-1323预测胃癌患者预后价值分析

图1 ROC曲线分析血清miR-369与miR-1323对胃癌患者预后的预测价值

2.5 血清miR-369、miR-1323水平与胃癌患者预后的关系 以胃癌患者miR-369、miR-1323表达均值0.75、1.27为界限,将患者分为miR-369高表达亚组63例、miR-369低表达亚组34例,miR-1323高表达亚组51例、miR-1323低表达亚组46例。采用Kaplan-Meier法分析胃癌患者血清miR-369、miR-1323水平与患者预后的关系,结果显示,miR-369低表达亚组患者3年累积生存率(35/63,55.56%)显著低于miR-369高表达亚组患者(24/34,70.59%),差异有统计学意义(χ2=3.974,P=0.046);miR-1323高表达亚组患者3年累积生存率(21/51,41.18%)显著低于miR-1323低表达亚组患者(38/46,82.61%),差异有统计学意义(χ2=22.315,P<0.001),见图2。

2.6 多因素Cox回归分析影响胃癌患者预后的因素 以胃癌患者预后为因变量(预后不良=1,预后良好=0),以miR-369(低表达=1,高表达=0),miR-1323(高表达=1,低表达=0),分化程度(低分化=1,高、中分化=0);TNM分期(Ⅲ+Ⅳ期=1,Ⅰ+Ⅱ期=0),淋巴结转移(有=1,无=0)、肿瘤直径(≥5 cm=1,<5 cm=0),浸润深度(T4=1,T1～T3=0)为自变量进行Cox回归分析,结果显示miR-369低、miR-1323高、分化程度低、TNM分期高、淋巴结转移、浸润深度高是胃癌患者预后不良的危险因素(P<0.05),见表5。

图2 血清miR-369、miR-1323表达与胃癌患者预后的关系

表5 Cox回归分析影响胃癌患者预后的因素

3 讨 论

胃癌是一种起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤,该疾病在患者早期不易察觉,到院就诊时已是中晚期,治疗比较困难,患者术后复发风险较高,对患者的预后构成严重威胁。根治性切除术是目前治疗胃癌主要方法之一,但部分患者手术疗效欠佳,患者术后复发转移风险较高,5年生存率较低[11]。miRNA是近年来临床肿瘤分子生物学研究的热点,其作为肿瘤抑制因子或致癌基因发挥作用,其异常表达会影响肿瘤细胞的增殖、侵袭、分化等多种功能,在胃癌的发生和发展过程中发挥关键作用[12-16]。miRNA参与胃癌细胞增殖、分化及凋亡等多个过程,有望成为胃癌早期诊断和预后监测的标靶因子。

Dong等[17]采用qRT-PCR检测miR-369-3p在胃癌组织中的表达,发现miR-369-3p水平较正常胃组织显著降低。本研究发现,病例组血清miR-369水平显著低于健康对照组,预后不良亚组血清miR-369水平显著低于预后良好亚组,与既往研究结果相似,提示血清miR-369参与胃癌的发生,其低表达可能促进了癌细胞的增殖,且与患者预后不良有关。研究显示,miR-1323在食管癌组织中呈高表达,并且其表达与临床分期、肿瘤直径、分化程度和淋巴结转移有关[18]。孙婧悦等[2]研究发现,miR-1323在胃癌组织中的表达显著高于对照组,经ROC曲线分析其对胃癌诊断的敏感度达100%,AUC为0.908。本研究结果显示,胃癌患者血清miR-1323水平显著高于健康对照组,预后不良亚组血清miR-1323水平显著高于预后良好亚组,其预测胃癌预后不良的AUC为0.823,敏感度为0.947,提示miR-1323高表达参与了胃癌的发生,并且与患者的预后不良关系密切,可作为胃癌预后不良的生物靶标应用于临床检测。杨建华等[19]研究发现,较高的TNM分期、淋巴结转移是胃癌患者预后的危险因素。谢兴旺等[20]研究发现,TNM分期、分化程度(低分化)是胃癌患者术后复发的危险因素。本研究经Cox回归分析,结果显示miR-369、miR-1323、分化程度、TNM分期、淋巴结转移、浸润深度是胃癌患者预后不良的影响因素,与前人研究结果一致,提示miR-369、miR-1323与胃癌患者预后及癌细胞的侵袭、转移有关。

综上所述,miR-369在胃癌患者血清中呈低表达,miR-1323呈高表达,二者与患者临床病理特征相关,联合检测对患者预后具有良好的预测价值,并且是患者预后不良的影响因素。本研究局限在于,纳入样本量较少,后续将扩大样本量进一步探讨miR-369与miR-1323在胃癌患者中的作用机制,以期为改善胃癌患者的预后提供新的生物标志物。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

杨思雨:设计研究方案,实施研究过程,论文撰写;姜淮芜:提出研究思路,分析试验数据,论文审核;姚晖、周航宇:实施研究过程,资料搜集整理,论文修改;马波:进行统计学分析