血清miR-326与治疗相关性血液系统恶性肿瘤患者化疗敏感性和预后的关系

陈 哲 张 灵 刘 洁 王 霞 张 斌 高炳华

（1.河北北方学院附属第一医院血液科，河北 张家口 075000；2.河北北方学院附属第一医院检验科，河北 张家口 075000）

血液系统恶性肿瘤的治疗以放疗、化疗和造血干细胞移植为主，但放疗和/或化疗远期毒副作用可能导致治疗相关性肿瘤的发生，其中治疗相关性血液系统恶性肿瘤发病率较高[1]。血液系统恶性肿瘤是一组异质性疾病，是由造血干细胞或祖细胞发生突变，失去进一步分化成熟的能力而被阻滞在不同阶段导致的[2]。目前，对于治疗相关性血液系统恶性肿瘤尚无标准化的治疗方案，临床应遵循个体化原则，最大程度改善患者预后。因此，寻找新的指标对患者化疗敏感性、预后预测和指导治疗意义重大。微小RNA是长度约为22个核苷酸的小分子RNA，参与肿瘤的多种恶性生物学行为，如细胞增殖、侵袭、转移、凋亡，其水平与肿瘤的发生、发展密切相关[3]。微小RNA-326（microRNA-326，miR-326）作为一种抑癌基因，在多种恶性肿瘤中发挥作用[4]。有研究发现，该基因低表达与食道鳞状细胞癌、非小细胞肺癌转移风险呈正相关[5]，但在治疗相关性血液系统恶性肿瘤中的研究鲜有报道。本研究拟分析治疗相关性血液系统恶性肿瘤患者血清miR-326表达水平，并探讨其与化疗敏感性和预后的关系。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2012年1月—2021年1月河北北方学院附属第一医院血液科50例治疗相关性血液系统恶性肿瘤患者（研究组），其中男29例、女21例，年龄（49.68±10.54）岁，体重指数（body mass index，BMI）为（22.54±2.17）kg/m2。纳入标准：1）符合《血液病诊断及疗效标准》[6]中治疗相关性血液系统恶性肿瘤的诊断标准；2）经细胞形态学、免疫学、细胞遗传学、分子生物学和病理学检查确诊为治疗相关性血液系统恶性肿瘤；3）影像学检查证实肿瘤无髓外转移；4）由原发肿瘤放疗、化疗后继发为治疗相关性血液系统恶性肿瘤；5）入院后接受化疗；6）完成随访；7）年龄≥18岁。排除标准：1）近期发生急、慢性严重感染；2）入院前6个月内发生过大面积心肌梗死、心源性休克、急性心力衰竭等严重疾病；3）中途退出治疗或随访期间失访、死亡；4）患严重肝、肾疾病或精神疾病；5）同时参与其他临床试验；6）发生非肿瘤病症阻碍继续治疗。以同期河北北方学院附属第一医院40例无原发实体瘤的血液系统恶性肿瘤患者作为对照组，其中男22例、女18例，年龄（50.12±11.08）岁，BMI为（22.15±2.35）kg/m2；包括骨髓增生异常综合征10例、急性髓系白血病（非M3）8例、急性早幼粒细胞白血病12例、急性淋巴细胞白血病10例。2个组之间性别、年龄、BMI差异均无统计学意义（P>0.05）。本研究经河北北方学院附属第一医院医学伦理委员会批准，所有研究对象及其家属均知情同意，并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 血清miR-326相对表达量检测

采集研究组化疗前、后和对照组清晨空腹静脉血5 mL，1 308×g离心10 min，收集血清。提取血清总RNA，采用TaqMan microRNA逆转录试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司）将RNA逆转录成互补DNA（complementary DNA，cDNA），根据SteataPrep RCR纯化试剂盒[安捷伦科技（中国）有限公司]说明书要求配制聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）体系，检测仪器为MA-6000实时荧光定量PCR仪（苏州雅睿生物技术股份有限公司）。反应条件：95 ℃预变性20 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，40个循环；72℃ 10 min。以U6为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算miR-326的相对表达量。miR-326和U6引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成，miR-326正向引物为5'-GCGCGTGGTTCTAGACTTGC-3'，反向引物为5'-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3'；U6正向引物为5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，反向引物为5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.2.2 随访和分组

根据文献[6]的标准将研究组再分为化疗有效组（35例）和化疗无效组（15例）。对研究组随访至2022年1月，记录终点事件（随访终点为全因死亡），根据终点事件发生与否将研究组分为存活组（28例）和死亡组（22例）。

1.2.3 临床资料收集

收集存活组和死亡组的临床资料，包括性别、年龄、BMI、基础疾病（高血压、糖尿病、高血脂等）、感染、凝血功能、原发肿瘤类型和治疗方案、再发肿瘤类型和治疗方案、再发肿瘤化疗周期、脏器功能损伤程度、住院天数。

1.3 统计学方法

采用SPSS 26.0软件进行统计分析。呈正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用独立样本t检验。计数资料采用例或率表示，组间比较采用χ2检验。采用Spearman相关分析评估血清miR-326相对表达量与治疗相关性血液系统恶性肿瘤患者化疗敏感性的相关性。采用Logistic回归分析评价患者临床特征与治疗相关性血液系统恶性肿瘤患者预后的关系。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评价血清miR-326相对表达量预测治疗相关性血液系统恶性肿瘤患者预后的效能。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究组和对照组血清miR-326相对表达量比较

研究组血清miR-326相对表达量（0.38±0.05）显著低于对照组（1.46±0.15）（P<0.001）。

2.2 化疗有效组和化疗无效组化疗前、后血清miR-326相对表达量比较

2个组化疗前血清miR-326相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）；化疗有效组化疗后血清miR-326相对表达量较化疗前升高（P<0.05）；化疗无效组化疗前、后血清miR-326相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 化疗有效组和化疗无效组化疗前、后血清miR-326相对表达量比较

2.3 血清miR-326相对表达量与治疗相关性血液系统恶性肿瘤患者化疗敏感性的相关性

Spearman相关分析结果显示，血清miR-326相对表达量与治疗相关性血液系统恶性肿瘤患者化疗敏感性呈正相关（r=0.641，P<0.05）。

2.4 存活组和死亡组临床资料比较

死亡组高血压、感染、凝血功能异常、再发肿瘤化疗周期（≥5个）、脏器功能损伤所占比例均高于存活组（P<0.05），血清miR-326相对表达量低于存活组（P<0.05）；2个组性别、年龄、BMI、糖尿病、高血脂、原发肿瘤类型和治疗方案、再发肿瘤类型和治疗方案、住院天数比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2 存活组和死亡组临床资料比较

2.5 治疗相关性血液系统恶性肿瘤患者预后危险因素分析

将治疗相关性血液系统恶性肿瘤患者预后情况作为因变量（Y），将存活组和死亡组临床资料比较差异有统计学意义的因素[高血压、感染、凝血功能异常、再发肿瘤化疗周期（≥5个）、脏器功能损伤、血清miR-326相对表达量]作为自变量（X）进行Logistic回归分析（赋值结果见表3），结果显示，感染、凝血功能异常、脏器功能损伤、低血清miR-326相对表达量均是治疗相关性血液系统恶性肿瘤患者预后不良的危险因素（P<0.05）。见表4。

表3 Logistic回归分析赋值

表4 治疗相关性血液系统恶性肿瘤患者预后多因素Logistic回归分析

2.6 血清miR-326相对表达量对治疗相关性血液系统恶性肿瘤患者预后的预测价值

ROC曲线分析结果显示，血清miR-326相对表达量判断治疗相关性血液系统恶性肿瘤患者预后的ROC曲线下面积为0.868（95%可信区间为0.777～0.959），最佳临界值为0.44，敏感性和特异性分别为86.80%和78.10%，约登指数为0.649，P<0.001。见图1。

图1 血清miR-326相对表达量预测治疗相关性血液系统恶性肿瘤患者预后的ROC曲线

3 讨论

目前，恶性肿瘤患者治疗相关性血液系统恶性肿瘤的发生机制尚不明确，多数研究结果表明放疗或化疗或为主要危险因素[7]。放疗可引起造血干细胞DNA碱基脱落、转换、颠覆，产生移码突变或点突变，以及染色体畸变，某些化疗药物，如细胞毒药物烷化剂（铂类、环磷酰胺），可与DNA交联导致基因突变，继而导致细胞增殖失控、分化受阻，而拓扑异构酶抑制剂可与DNA、拓扑异构酶Ⅱ形成三联体，阻断拓扑异构酶连接活性，使DNA链断裂，从而增加治疗相关性血液系统恶性肿瘤的发生风险[8-9]。另外，宿主和环境因素等也可能与治疗相关性血液系统恶性肿瘤的发生关系密切，不同个体基因多态性在编码药物代谢相关酶系、DNA修复、药物转运和靶点方面的差异决定了患者的肿瘤易感性[10]。

目前尚缺乏治疗相关性血液系统恶性肿瘤的特异性生物标志物，难以评估不同治疗方案对患者预后的影响，亟需寻找新指标。有研究结果表明，miR-326在胃癌组织中的相对表达量明显低于癌旁组织，且与肿瘤大小、淋巴转移、分化程度和临床分期均有关[11]；miR-326在脑胶质瘤组织中的表达显著低于正常脑组织，与晚期病理分级和KPS评分等有关[12]。提示miR-326在多种类型恶性肿瘤中异常表达，并通过多种途径参与细胞增殖和凋亡过程，影响疾病进程。然而，miR-326在治疗相关性血液系统恶性肿瘤中是否异常表达鲜有报道。本研究中，研究组血清miR-326相对表达量低于对照组（P<0.001）。说明血液系统恶性肿瘤患者血清miR-326表达异常，提示miR-326可能作为抑癌基因存在于患者血液中，其表达下降可能会激活相关癌基因，从而参与治疗相关性血液系统恶性肿瘤的发生、发展，在临床治疗过程中应重点监测[13-14]。有学者指出，部分微小RNA在恶性肿瘤患者化疗过程中对肿瘤细胞化疗敏感反应有一定调控作用。本研究结果显示，化疗有效组化疗后血清miR-326相对表达量较化疗前有所升高，而化疗无效组化疗前、后血清miR-326相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）；相关分析发现，血清miR-326相对表达量与治疗相关性血液系统恶性肿瘤患者化疗敏感性呈正相关（r=0.641，P<0.05），表明miR-326表达下调与治疗相关性血液系统恶性肿瘤患者化疗抵抗有关。

已有大量研究将血清微小RNA作为肿瘤生物标志物用于疾病诊断和预后评估，使通过血清miRNA判断治疗相关性血液系统恶性肿瘤患者预后成为可能。本研究中，死亡组血清miR-326相对表达量低于存活组（P<0.001）；Logistic回归分析结果显示，低水平血清miR-326是治疗相关性血液系统恶性肿瘤患者预后不良的危险因素之一。以上结果均提示miR-326低表达与治疗相关性血液系统恶性肿瘤患者较差的预后有关。GHODOUSI等[15]发现，miR-326低表达是急性淋巴细胞白血病患儿生存和预后不良的生物标志物；生物信息学分析数据显示，miR-326可能对急性淋巴细胞白血病微小RNA具有调节作用，可能诱发急性淋巴细胞白血病患儿对治疗药物耐药。本研究ROC曲线分析结果显示，血清miR-326相对表达量判断治疗相关性血液系统恶性肿瘤患者预后的曲线下面积为0.868，当血清miR-326相对表达量<0.44时，提示治疗相关性血液系统恶性肿瘤患者有预后不良风险，说明血清miR-326对治疗相关性血液系统恶性肿瘤患者预后预测价值良好。ABERUYI等[16]也发现，miR-326表达在急性淋巴细胞白血病患儿的预后中具有良好预测价值，与本研究结果一致。因此，临床在积极控制治疗相关性血液系统恶性肿瘤患者感染、凝血功能异常、化疗周期、脏器功能损伤等常见危险因素的同时，也应密切关注并监测血清miR-326相对表达量变化，以便及时采取应对措施，改善患者预后。

综上所述，血清miR-326相对表达量与治疗相关性血液系统恶性肿瘤患者化疗敏感性和预后关系密切，对患者预后有较高的预测价值。但本研究样本量和随访时间有限，有待通过更深入的研究来弥补不足。