基于Nrf2/HO-1信号通路研究白藜芦醇在小鼠卵巢冷冻复苏中的保护作用及机制

张珦， 李惠， 章宜芬， 郑燕影， 孙怡， 陈劼， 储乐乐， 应葳， 李长印， 郑艳莉

（南京中医药大学附属医院病理科，江苏南京 210000）

肿瘤放化疗作为癌症的主要治疗手段，对女性卵巢功能的损害主要是会引起卵泡凋亡和卵巢间质损伤[1]。育龄女性肿瘤患者放化疗后的生育能力保存一直是生殖领域被关注的热点之一。卵巢皮质冷冻复苏经原位移植后，卵泡可以自然发育并排卵。因此，卵巢皮质冷冻在生育力保存中的重要性正在受到越来越多生殖专家的关注。然而卵巢皮质冷冻技术还需要进一步改进和优化，如何在卵巢组织冷冻复苏和移植过程中减少原始卵泡的损失，提高移植后卵泡的存活率，对女性生育力保存技术的发展具有重要意义[2]。

白藜芦醇是一种植物抗毒素，属于多酚类化合物，存在于葡萄、虎杖、花生等植物中，研究表明，白藜芦醇具有抗炎、抗肿瘤、抗细菌、抗病毒、抗氧化等药理活性[3]。白藜芦醇作为一种作用较强的天然抗氧化剂，在多种组织和器官中发挥着抗凋亡作用，既往研究发现白藜芦醇通过影响核因子E2 相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/血红素加氧酶1（hemeoxygenase 1，HO-1）信号通路，增强Nrf2 蛋白的表达，减轻细胞氧化应激损伤[4]，但这种保护作用在卵巢冷冻复苏中是否存在，还需要进一步证实。

本研究采用新生小鼠卵巢冷冻复苏移植为模型，在冷冻复苏液中加入白藜芦醇，通过检测复苏后卵巢组织凋亡，观察移植后小鼠各级卵泡数量及卵巢组织形态变化及卵巢组织中剪切型多聚ADP 核糖多聚糖（Cleaved-PARP）、Nrf2/HO-1信号通路关键蛋白的表达变化，探讨白藜芦醇减少卵巢冷冻复苏损伤的作用机制，以期为白藜芦醇在卵巢冷冻复苏中的应用提供理论依据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物取31 只SPF 级5 日龄雌性CD-1小鼠，10 只SPF 级6 周龄雌性CD-1 小鼠，体质量20 ～25 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0006。实验动物饲养于南京医科大学医药实验动物中心，昼夜节律12 h/12 h，环境温度（25±2）℃，相对湿度（50±5）%。动物实验研究内容经南京医科大学实验动物伦理委员会审核通过，伦理编号：1811040。

1.2 主要试剂与仪器L15 培养基（Gibco 公司）；MEM-α（美国Gibco 公司）；磷酸盐缓冲液（PBS，广州洁特生物过滤股份有限公司）；卵巢冷冻液、卵巢复苏液（日本KITAZATO BioPharma 公司）；Nrf2抗体（美国Proteintech 公司）；HO-1抗体（美国Abcam 公 司）；Cleaved-Caspase-3 抗 体、PARP抗体、Cleaved-PARP 抗体（美国CST 公司）；β-tubulin（南京翼飞雪生物科技有限公司）；末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记（TUNEL）异硫氰酸荧光素（FITC）标记的凋亡检测试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；山羊血清、免疫组织化学检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒、山羊抗小鼠IgG（H+L）-辣根过氧化物酶（HRP）二抗、山羊抗兔IgG（H+L）-HRP 二抗（南京翼飞雪生物科技有限公司）。倒置显微镜（日本Nikon 公司，型号：TS100）；体式显微镜（日本Nikon公司，型号：SMZ1000）；数码化学发光成像系统（上海Tanon公司，型号：4500SF）；37 ℃细胞培养箱（美国Thermo 公司，型号：150i）；低温离心机（德国Eppendorf公司，型号：5702R）。

1.3 新生小鼠卵巢分离、冷冻、复苏选取5 日龄CD-1雌性小鼠13只，处死后酒精消毒，背部取出双侧卵巢（共26 只卵巢）用于冷冻复苏后进行TUNEL 和Cleaved-Caspase-3 免疫组织化学染色。将卵巢分为空白对照组，模型对照组，白藜芦醇0.5、2.5、5 μmol·L-1组共5组，每组5只。白藜芦醇3 个剂量组卵巢在冷冻前用含有0.5、2.5、5 μmol·L-1白藜芦醇的MEM-α 体外培养1 h，随后置于含有相同剂量的白藜芦醇的冷冻液中液氮冷冻，模型对照组卵巢置于空白冷冻液中进行液氮冷冻，4 组均液氮中保存。5 d 后取出组织，模型对照组置于空白复苏液中进行复苏，白藜芦醇3个剂量组分别置于含有0.5、2.5、5 μmol·L-1白藜芦醇的复苏液中复苏。空白对照组不做冷冻复苏处理。根据TUNEL染色结果选择白藜芦醇剂量5 μmol·L-1，并取空白对照组、模型对照组及白藜芦醇5 μmol·L-1组卵巢组织切片进行Cleaved-Caspase-3 免疫组织化学染色及后续实验。

另取8只5日龄CD-1雌性小鼠，背部取出双侧卵巢（共16 只卵巢）用于Western Blot蛋白检测，分为空白对照组、模型对照组及白藜芦醇5 μmol·L-1组，每组5只卵巢，空白对照组不进行冷冻复苏直接提取蛋白，模型对照组及白藜芦醇组同上处理。

剩余10 只5 日龄CD-1 雌性小鼠卵巢用于冷冻复苏后肾被膜移植实验。将来源于同只小鼠的双侧卵巢，一侧卵巢置于空白培养基中，为模型对照组，另一侧卵巢置于含有5 μmol·L-1白藜芦醇的培养基中设为白藜芦醇组，培养1 h 后取出卵巢组织。模型对照组卵巢放置于空白冷冻液中冷冻，白藜芦醇组卵巢放置于含有5 μmol·L-1白藜芦醇的冷冻液中冷冻后，2 组均置于液氮中保存。5 d后取出组织，模型对照组卵巢置于空白复苏液中进行复苏，白藜芦醇卵巢组置于含有5 μmol·L-1白藜芦醇的复苏液中复苏后立即进行移植。

1.4 新生小鼠卵巢异体肾被膜下移植选取6 周龄CD-1雌鼠10只作为受体鼠，腹腔注射240 mg/kg阿弗丁给小鼠进行麻醉，将复苏后的同1只小鼠的卵巢组织（1只卵巢为模型对照组，另1只卵巢为白藜芦醇组）分别移到受体鼠的两侧肾被膜下，同时摘除受体鼠双侧卵巢[5]。送回动物中心饲养，于移植后第5天取材5 只，移植后第14天取材5 只，取出移植卵巢，采用中性福尔马林溶液固定卵巢组织后石蜡包埋切片（厚5 μm）。

1.5 观察指标与方法

1.5.1 TUNEL FITC 染色法观察卵巢组织细胞凋亡 按照TUNEL FITC 诺维赞A111-01 说明书操作染色，荧光显微镜下拍照。

1.5.2 免疫组织化学染色法检测卵巢组织Cleaved-Caspase-3 表达 将石蜡组织切片于65 ℃烘箱中烘干后，放置于二甲苯、梯度乙醇中各2 min，单蒸水清洗2 次，采用3%过氧化氢-甲醇去除内源性过氧化物。然后在柠檬酸钠抗原修复液中煮沸15 min，山羊血清室温封闭。加入Cleaved-Caspase-3抗体，4 ℃湿盒过夜，TBS清洗，加入二抗孵育1 h，TBS 清洗，加入三抗孵育1 h 后，清洗。DAB显色后苏木素染色，正置显微镜下拍照。

1.5.3 小鼠卵巢组织连续切片后卵泡总数及各级卵泡数的记录 异体移植后的卵巢组织连续切片后，进行HE 染色，置于显微镜下观察，统计各级卵泡数量。根据文献研究[5]标准，按照细胞核计数，扁平颗粒细胞为原始卵泡，一层立方形颗粒细胞为初级卵泡，一层以上立方形颗粒细胞为次级卵泡，出现腔隙为有腔卵泡。正常卵泡呈圆形，颗粒细胞分布均匀。异常卵泡卵母细胞不完整或消失，颗粒细胞排列不规则，部分脱落，部分可见卵母细胞核固缩或皱缩[6]。

1.5.4 Western Blot法检测复苏卵巢中蛋白表达的变化 提取卵巢组织总蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法测定样本的蛋白浓度，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，聚偏氟乙烯（PVDF）转膜，脱脂奶粉封闭后，加入兔源Nrf2 抗体（1∶800 稀 释）、HO-1 抗 体（1∶800 稀 释）、Cleaved-Caspase-3 抗体（1∶800 稀释）、PARP 抗体（1∶800 稀释）、Cleaved-PARP（1∶800 稀释）以及β-tubulin 抗体（1∶2 000 稀释），4 ℃孵育过夜，TBST漂洗，加入二抗孵育1 h后，加入ECL发光液显影。采用图像分析软件对条带进行灰度分析，量化目的蛋白的表达。

1.6 统计方法采用Graphpad Prism 6.0 软件进行统计学分析。结果数据以均数± 标准差（±s）表示，2 组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白藜芦醇对冷冻复苏后卵巢组织中细胞凋亡的影响图1结果显示，冷冻复苏处理后的卵巢组织（模型对照组）出现TUNEL 荧光信号强度，随着白藜芦醇处理浓度（0.5、2.5、5 μmol·L-1）的增加，TUNEL 荧光信号强度逐渐降低，表明白藜芦醇可以降低冷冻复苏后卵巢组织中的细胞凋亡，并呈浓度依赖性，确定后续实验的白藜芦醇处理浓度为5 μmol·L-1。

图1 TUNEL荧光染色检测卵巢组织细胞凋亡结果Figure 1 Results of TUNEL fluorescence staining detecting apoptosis in ovarian tissue

2.2 白藜芦醇对冷冻复苏后卵巢组织中凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3表达的影响图2结果显示，冷冻复苏处理后的卵巢组织（模型对照组）出现凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3 阳性细胞数增加（P＜0.05）。加入5 μmol·L-1白藜芦醇处理后，白藜芦醇组凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3 阳性细胞数较模型对照组显著减少（P＜0.01），表明冷冻复苏对新生小鼠卵巢组织造成了凋亡损伤，白藜芦醇可以抑制冷冻复苏过程中卵巢组织凋亡。

图2 卵巢组织Cleaved-Caspase-3免疫组织化学染色结果Figure 2 Immunohistochemical staining results of ovarian tissue for Cleaved-Caspase-3

2.3 白藜芦醇对冷冻复苏后卵巢组织中卵泡存活的影响图3、表1 和图4、表2 结果显示，白藜芦醇5 μmo·L-1组卵巢移植5、14 d 后的卵泡总存活率较模型对照组均明显增多，差异有统计学意义（P＜0.05）。移植5 d后进行卵泡计数发现，白藜芦醇5 μmol·L-1组原始卵泡存活率较模型对照组均明显改善（P＜0.05）。移植14 d 后各级卵泡计数显示，白藜芦醇5 μmol·L-1组初级卵泡、窦卵泡存活率较模型对照组均明显增加（P＜0.05）。表明白藜芦醇可以增加冷冻复苏后卵巢组织中卵泡的数量，减少冷冻复苏中卵泡的丢失，改善移植卵巢组织卵泡的存活率，卵泡后期发育情况优于模型对照组。

图3 卵巢移植5 d后HE染色结果（×20）Figure 3 HE staining results at 5 days after ovarian transplantation（×20）

图4 卵巢移植14 d后HE染色结果Figure 4 HE staining results at 14 days after ovarian transplantation

表1 卵巢移植5 d后各级卵泡计数结果Table 1 Follicle count results at all levels at 5 days after ovarian transplantation（±s，n=5）

注：卵泡存活率=存活卵泡数/总卵泡数×100%。①P＜0.05，与模型对照组比较

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表2 卵巢移植14 d后各级卵泡计数结果Table 2 Follicle count results at 14 days after ovarian transplantation （±s，n=5）

表2 卵巢移植14 d后各级卵泡计数结果Table 2 Follicle count results at 14 days after ovarian transplantation （±s，n=5）

注：卵泡存活率=存活卵泡数/总卵泡数×100%。①P＜0.05，与模型对照组比较

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2.4 白藜芦醇对冷冻复苏后卵巢组织中Nrf2/HO-1信号通路蛋白表达的影响图5结果显示，新鲜的小鼠卵巢组织经过冷冻复苏损伤后，模型对照组凋亡蛋白Cleaved-PARP/PARP 比值明显增加，抗氧化蛋白Nrf2、HO-1 表达水平显著降低，与空白对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。卵巢组织经过冷冻复苏并移植5 d后，白藜芦醇处理组抗氧化蛋白Nrf2 表达水平明显升高，凋亡蛋白Cleaved-PARP/PARP 比值明显减低，与模型对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），HO-1 表达水平升高，但与模型对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。表明白藜芦醇可以通过Nrf2/HO-1 信号通路减轻冷冻复苏后卵巢组织氧化应激损伤。

图5 各组卵巢组织Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白检测结果Figure 5 Determination results of Nrf2/HO-1 signaling pathway related proteins in ovarian tissue

3 讨论

生殖医学的快速发展促进了各种生育力保存技术的进步。胚胎、卵母细胞和卵巢皮质的冷冻保存可以使女性肿瘤患者在癌症治愈后继续生育[7]。但胚胎冷冻法在青春期前和无配偶的女性肿瘤患者中应用，卵母细胞冷冻也还尚未完全成熟。成熟卵母细胞在冷冻复苏过程中存在着细胞纺锤体、细胞骨架和透明带的损伤，存在潜在的子代遗传安全隐患[8]。冷冻卵巢组织经复苏处理后可以通过原位或异位移植重建卵巢功能。卵巢皮质冷冻复苏移植后，卵泡可以自然发育并排卵。截至2017 年，全世界已经有80 多例应用该方法的婴儿出生[9]。然而，卵巢皮质冷冻技术存在一定的技术难度，并未得到广泛应用。同时，在皮质复苏和移植过程中会损失大量的原始卵泡，影响治疗效果[10]。卵巢组织复苏移植过程中，复苏回移的组织中会产生大量的氧自由基，引起卵泡的闭锁和卵巢间质细胞的大量损伤。此外，移植后新生血管再灌注也会促使移植卵巢组织中产生氧自由基、炎症递质等，进一步造成卵泡与卵巢间质细胞的凋亡[11]。因此，如何降低回移卵巢组织的氧化应激十分重要。

Nrf2是一种广泛存在于各种组织细胞中的转录因子，其表达水平与氧化应激水平有关，能够调节炎症与氧化应激基因的表达，在机体抗氧化应激损伤中起着重要的作用；HO-1 是血红素分解代谢过程中的限速酶，可降解血红素为一氧化碳、胆绿素和亚铁离子，是Nrf2 发挥抗炎和抗氧化作用的关键分子[12]。Nrf2/HO-1 途径是机体氧化应激调控的重要信号通路，活性氧（ROS）的大量产生可使损伤组织Nrf2 表达升高，激活下游抗氧化基因HO-1 表达进而增强细胞的抗氧化应激能力[13]。动物实验表明，Nrf2/HO-1 级联反应对缺血再灌注损伤过程中的氧化应激和炎症反应均具有显著的抑制效果，当Nrf2/HO-1 表达上调时，ROS 水平降低，炎症因子的产生显著减少[14]。

白藜芦醇为含有二苯乙烯结构的多酚类化合物，其在神经系统、心脑血管系统、肿瘤、炎症等方面均有广阔的应用前景[3]。近年来白藜芦醇在生殖力保存中，也有广泛的报道。在精液冷冻保护液中添加白藜芦醇可以通过降低精子内ROS 水平减少精子冷冻损伤，从而改善解冻后精子的质量和功能[15]。在冻融小鼠卵巢组织自体移植中，白藜芦醇可以通过下调NF-κB，从而减少炎症因子IL-6 的产生，减少卵巢组织自体移植的卵泡丢失，白藜芦醇还可以通过增加超氧化物歧化酶（SOD）的表达、减少丙二醛（MDA）的产生，防止细胞膜脂质过氧化对卵母细胞的损伤[16]。在胚胎玻璃化冷冻复苏中，白藜芦醇可以改善玻璃化冷冻-解冻后胚胎线粒体分布异常和功能损伤[17]。此外，白藜芦醇还可以通过增加线粒体DNA（mtDNA）拷贝数和ATP 含量改善卵母细胞成熟率、受精率和优质胚胎率[18]。但是，白藜芦醇对新生小鼠卵巢冷冻复苏的保护作用及其对Nrf2/HO-1 通路的调控作用尚未见报道。为了研究白藜芦醇处理的冷冻复苏新生小鼠卵巢中卵泡的长期发育情况，需要将新生小鼠卵巢组织进行异体移植后体内发育。由于新生小鼠卵巢组织较小，无法进行卵巢组织原位移植，而肾被膜下血管丰富，移植卵巢活动区域较为局限，手术切口损伤小，被认为是动物卵巢移植的适宜部位之一[19]。本研究结果显示，与模型对照组比较，白藜芦醇处理组的冷冻复苏卵巢中细胞凋亡明显减少，卵泡存活率增加，凋亡标志蛋白Cleaved-PARP 及Cleaved-Caspase-3 表达明显降低，证明白藜芦醇可以通过降低卵巢组织的凋亡水平来提高冷冻复苏后卵泡的存活率。Western Blot 结果证实，抗氧化蛋白Nrf2、HO-1 表达明显增强，提示卵巢组织的抗凋亡保护作用与Nrf2/HO-1 信号通路有密切的关系。

综上所述，在卵巢冷冻前用白藜芦醇对卵巢组织进行预处理，并在卵巢冷冻液及复苏液中同时加入白藜芦醇后，异体移植的冷冻复苏卵巢组织凋亡水平降低，卵泡存活率增加。本研究成果可为白藜芦醇作为临床中卵巢组织冷冻保护剂的开发提供一定的理论依据。但白藜芦醇在卵巢组织冷冻复苏中的临床应用，还需要进一步深入研究。