橙花叔醇对脓毒症急性肺损伤大鼠炎症反应及AMPK/SIRT1通路的影响

薛涵予， 王泽秀， 张晓丽

（1.普洱市中医医院肺系病科，云南普洱 665000；2.云南省中医医院肺病科，云南昆明 650000）

脓毒症是由宿主对感染的反应失调所导致的危及生命的器官功能障碍[1-2]。在脓毒症中，炎性细胞被激活并释放大量炎性介质，如肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素（IL）-1和氧自由基等，可导致组织和机体器官的严重损伤[3-4]。急性肺损伤是脓毒症的主要并发症之一，是以呼吸衰竭、肺泡-毛细血管膜屏障、肺水肿和免疫/炎症反应为特征的毁灭性疾病[5]。抑制炎症反应可以减轻脓毒症急性肺损伤并提高脓毒症的存活率[6-7]。

橙花叔醇（3，7，11-三甲基-1，6，10-十二碳三烯-3-醇，nerolidol，NRD）是一种脂肪族倍半萜醇，存在于生姜、香茅、柠檬草、玫瑰和茶树等精油中[8]，具有广泛的抗炎、抗氧化、抗菌和抗癌作用[9-12]。既往有研究报道，橙花叔醇可通过调节抗氧化酶和单磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）/核因子E2 相关因子2（Nrf2）/血红素加氧酶1（HO-1）通路抑制脂多糖（LPS）诱导的急性肺损伤过程中的炎症反应[13]。为进一步探讨橙花叔醇对脓毒症急性肺损伤的治疗作用及机制，本研究构建脓毒症急性肺损伤大鼠模型，观察橙花叔醇对其炎症反应的影响。研究发现，AMPK 是参与能量代谢调节的关键激酶，AMPK 通过激活下游效应分子在急性肺损伤中发挥保护作用[14]。SIRT1（Sirtuin1）是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖性组蛋白脱乙酰酶，具有抗炎和抗凋亡作用[15]，AMPK 具有SIRT1依赖性的抗炎活性。基于此，本研究观察橙花叔醇是否通过介导AMPK/SIRT1通路对脓毒症急性肺损伤发挥保护作用。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物取36 只SPF 级健康12 月龄雄性SD 大鼠，体质量300 ～350 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物生产许可证号：SCXK（沪）2022-0004，使用许可证号：SYXK（沪）2022-0012。

1.2 药物、试剂与仪器橙花叔醇（分子式：C15H26O，分子量：222.37，纯度：98%）（美国Santa Cruz 公司）。LPS（美国Sigma-Aldrich 公司）；AMPK 抑 制 剂Dorsomorphin（美 国R&D Systems 公司）；苏木素-伊红（HE）染液（上海Beyotime 公司）；白细胞介素（IL）-1β、IL-10 和肿瘤坏死因子（TNF）-α（美国R&D Systems 公司）； 兔抗磷酸化AMPK（p-AMPK）抗体、兔抗SIRT1 抗体、兔抗GAPDH 抗体（美国Santa Cruz 公司）。BioSystem XA全身体积描记肺功能检测仪（WBP，美国DSI 公司）；血细胞计数器（上海契景公司）；Eclipse Ci显微镜（日本Nikon 公司）；Infinite F50 酶标仪（瑞士Tecan 公司）。

1.3 分组、造模与给药将36 只大鼠随机分为6 组，分 别 为Sham 组、LPS 组、LPS+DMSO 组、LPS+NRD 组、LPS+NRD+DMSO 组、LPS+NRD+Dors组，每组6只。

腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）对大鼠进行麻醉后，背部卧床固定，分离右股静脉，对股静脉进行导管注射[16]。

动物处理具体方法如下。Sham 组：假手术组，股静脉注射8 mg/kg 磷酸盐缓冲液（PBS）；LPS 组：通过股静脉注射LPS 8 mg/kg建立脓毒症急性肺损伤模型；LPS+NRD 组：橙花叔醇预处理组，在LPS注射前30 min 尾静脉注射橙花叔醇100 mg/kg[16]；LPS+DMSO 组：橙花叔醇预处理阴性对照组，在LPS注射前30 min尾静脉注射5 mg/kg DMSO；LPS+NRD+DMSO 组：尾静脉注射橙花叔醇100 mg/kg 和5 mg/kg DMSO，然后股静脉注射LPS 8 mg/kg；LPS+NRD+Dors 组：尾静脉注射橙花叔醇100 mg/kg 和5 mg/kg AMPK 抑制剂Dorsomorphin[16]，然后股静脉注射LPS 8 mg/kg。

所有大鼠在LPS诱导24 h后用过量的戊巴比妥钠800 mg/kg 安乐死，收集支气管肺泡灌洗液（BALF）和肺组织。

1.4 观察指标与方法

1.4.1 肺功能检测 LPS 诱导后12 h 后，使用50 mg/kg戊巴比妥钠将大鼠麻醉，使用全身体积描记肺功能检测仪（WBP）进行检查。WBP 由一个压力传感器（MAX1320，Buxco Electronics，Sharon，CT）相互连接的参考室和动物室组成。根据Buxco肺部操作协议[17-18]，测定大鼠用力呼出25% ～75%肺活量时的呼气流量（FEF25%-75%）和20 毫秒用力呼气量/用力肺活量（FEV20/FVC）比值。

1.4.2 支气管肺泡灌洗液（BALF）收集和细胞计数 将大鼠处死后，使用0.5 mL 无菌PBS 进行支气管肺泡灌洗3 次（总体积＝1.5 mL），得到BALF。然后，使用血细胞计数器进行总白细胞计数和中性粒细胞计数。

1.4.3 苏木素-伊红（HE）染色法观察肺组织病理学形态 将大鼠肺组织样本用10%福尔马林溶液固定，包埋在石蜡中，然后切成3 ～4 μm切片。切片先后在二甲苯和乙醇中脱水。然后进行HE 染色。通过显微镜观察图像，并在成像系统（Digital Sight DS-FI2，Nikon，日本）上采集图像。采用Smith 评分法[19]评估肺损伤程度，肺泡和间质炎症、水肿，肺泡和间质出血、坏死，肺不张和透明膜形成均按照0 ～4 分制评分：无损伤，计0 分；损伤小于25%，计1 分；损伤25%～50%，计2 分；损伤50%～75%，计3分；损伤大于75%，计4分。

1.4.4 酶联免疫吸附分析（ELISA）检测BALF 中IL-1β、IL-10和TNF-α的水平 按照IL-1β、IL-10和TNF-α 试剂盒说明书操作，最后应用酶标仪在450 nm波长处检测光密度（OD）值。

1.4.5 Western Blot 法检测肺组织p-AMPK、SIRT1 蛋白表达水平 将肺组织均质化后，使用二喹啉甲酸（BCA）蛋白检测试剂盒测定上清液中的蛋白浓度。将等量的蛋白质（40 mg）加载到十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上，转移到尼龙膜上，分别与第一抗体兔抗p-AMPK、SIRT1、GAPDH（均按体积比1∶1 000 稀释）。然后，将膜与第二抗体辣根过氧化物酶（HRP）-山羊抗兔IgG 一起在室温下孵育1 h。通过化学发光法显色、曝光，最后应用AlphaEase 软件分析条带灰度值，以GAPDH作为内参。

1.5 统计方法采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，GraphPad Prism 8.0 软件进行图片制作。所有数据均以均数± 标准差（±s）表示。2 组间比较采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），事后检验均采用Tukey’s 多重比较法。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 橙花叔醇改善LPS 诱导的脓毒症急性肺损伤大鼠肺组织及肺功能LPS组和LPS+DMSO 组大鼠肺组织可见中性粒细胞浸润、肺泡壁增厚、出血和透明膜形成，LPS+NRD 组肺组织病理表现较LPS+DMSO 组好转。见图1-A。表明LPS 诱导脓毒症急性肺损伤大鼠肺组织出现明显炎性损伤，而橙花叔醇（NRD）预处理可减轻LPS诱导的脓毒症急性肺损伤大鼠肺组织病理损伤。

图1 橙花叔醇（NRD）对脂多糖（LPS）诱导的脓毒症急性肺损伤大鼠肺组织及肺功能的影响Figure 1 Effects of nerolidol on lung tissue and lung function in rats with LPS-induced sepsis-associated acute lung injury

Smith 评分结果显示：与Sham 组比较，LPS 组肺组织损伤评分增加（P＜0.001）；与LPS+DMSO组比较，LPS+NRD 组肺组织损伤评分减少（P＜0.01）。见图1-A。表明橙花叔醇可明显减轻脓毒症急性肺损伤大鼠肺组织损伤程度。

与Sham组比较，LPS组大鼠FEF25%-75%和FEV20/FVC 比值显著下降（P＜0.01）；与LPS+DMSO 组比较，LPS+NRD 组FEF25%-75%和FEV20/FVC 比值升高（P＜0.01）。见图1-B、图1-C。表明橙花叔醇能部分逆转脓毒症急性肺损伤大鼠肺功能的下降。

2.2 橙花叔醇抑制LPS 诱导的脓毒症急性肺损伤大鼠BALF炎症反应对BALF 中炎症细胞进行计数和分类，结果显示：与Sham 组比较，LPS 组和LPS+DMSO 组大鼠BALF 中总白细胞数、中性粒细胞数均显著增加（P＜0.01 或P＜0.001）；与LPS+DMSO 组比较，LPS+NRD 组大鼠BALF 中总白细胞数、中性粒细胞数均显著减少（均P＜0.01）。见图2-A。橙花叔醇可显著降低脓毒症急性肺损伤大鼠BALF白细胞及中性粒细胞水平。

图2 橙花叔醇（NRD）对脂多糖（LPS）诱导的脓毒症急性肺损伤大鼠BALF炎症反应的影响Figure 2 Effect of nerolidol on the inflammatory response of BALF in rats with LPS-induced sepsis-associated acute lung injury

TNF-α、IL-1β 和IL-10 为炎症相关因子[20]。ELISA 检测结果显示：与Sham 组比较，LPS 组和LPS+DMSO 组大鼠BALF 中TNF-α 和IL-1β 水平显著上升，IL-10 水平显著下降（均P＜0.01）；与LPS+DMSO 组 比 较，LPS+NRD 组 大 鼠BALF 中TNF-α 和IL-1β 水平显著下降，IL-10 水平显著上升（均P＜0.01）。见图2-B。表明橙花叔醇可调节脓毒症急性肺损伤大鼠BALF炎症因子的释放。

2.3 橙花叔醇通过激活AMPK/SIRT1通路减轻LPS诱导的大鼠脓毒症急性肺损伤通过Western Blot 法观察LPS 诱导脓毒症急性肺损伤大鼠肺组织匀浆中AMPK/SIRT1 通路相关蛋白表达结果显示，与Sham组比较，LPS组肺组织p-AMPK与SIRT1蛋白表达水平均显著降低（均P＜0.01）。见图3。结果表明，LPS 诱导的脓毒症急性肺损伤大鼠肺组织AMPK/SIRT1通路被抑制。

图3 脂多糖（LPS）诱导对大鼠肺组织AMPK/SIRT1通路相关蛋白表达的影响Figure 3 Effect of LPS induction on AMPK/SIRT1 pathway-related protein expression in rat lung tissue

为了确定橙花叔醇是否通过激活AMPK 发挥抗炎作用，在使用橙花叔醇治疗大鼠脓毒症急性肺损伤的同时使用AMPK 抑制剂（Dorsomorphin，Dors）来抑制AMPK 磷酸化。结果显示：与LPS+NRD+DMSO 组比较，LPS+NRD+Dors 组肺组织p-AMPK 及SIRT1 蛋白表达水平下降（P＜0.01）。见图4-A。提示Dors 成功抑制了橙花叔醇对脓毒症急性肺损伤大鼠肺组织AMPK 磷酸化及SIRT1蛋白表达的促进作用。且在Dors 的应用下，橙花叔醇减轻的大鼠肺组织病理及功能损伤被逆转，表现在肺损伤严重，FEF25%-75%和FEV20/FVC 水平均显著下降（见图4-B ～D）。此外，AMPK 抑制剂Dors显著升高橙花叔醇干预的BALF中炎症细胞数量及炎症因子TNF-α、IL-1β 水平，显著降低抗炎症因子IL-10 水平（均P＜0.01，见图4-E、图4-F）。上述结果表明，橙花叔醇可通过激活AMPK/SIRT1通路保护脓毒症急性肺损伤大鼠。

图4 橙花叔醇（NRD）通过激活AMPK/SIRT1通路对大鼠脓毒症急性肺损伤的影响Figure 4 Effect of nerolidol on sepsis-induced acute lung injury in rats through activation of AMPK/SIRT1 pathway

3 讨论

炎症被认为是对感染或损伤的主要反应。然而，炎症不受控制的延长可导致组织损伤[21-22]。LPS 是急性肺损伤发生的常见内毒素[23]。研究[24-25]发现，LPS 可以显著上调中性粒细胞和单核白细胞的积累、上调炎性因子的表达水平。炎症浸润是急性肺损伤的关键因素，它导致肺功能进行性恶化[26]。白细胞，尤其是中性粒细胞，是急性肺损伤发病机制的“罪魁祸首”。LPS 诱导后，来自肺泡巨噬细胞和肺细胞的促炎介质会刺激外周循环中的中性粒细胞活化[27]。中性粒细胞的迁移、呼吸爆发和脱粒对先天免疫系统至关重要[28]。本研究结果显示，LPS诱导脓毒症急性肺损伤大鼠肺功能、肺组织明显受损，炎性细胞浸润明显，且BALF 中中性粒细胞和单核白细胞募集，且伴随BALF 中TNF-α、IL-1β表达的显著升高，抗炎性因子IL-10水平的显著降低。橙花叔醇可抗炎[29]。给予橙花叔醇预防干预后，橙花叔醇可减轻LPS诱导的脓毒症急性肺损伤大鼠肺组织病理损害及肺功能损伤，降低BALF 中总白细胞数、中性粒细胞数及炎症因子IL-1β 和TNF-α 水 平，提高BALF 中IL-10水平，上调肺组织p-AMPK、SIRT1 蛋白表达水平。表明橙花叔醇可减轻脓毒症急性肺损伤大鼠炎症反应。

AMPK 是一种广泛存在于真核生物中的能量敏感性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，对于调节能量代谢和线粒体生物发生以应对能量剥夺至关重要[14]；SIRT1 是一种NAD+依赖性组蛋白脱乙酰酶，是参与细胞能量平衡的代谢酶[15]。既往研究表明，AMPK的敲低明显加重了LPS 诱导的小鼠脓毒症急性肺损伤[30-31]。本研究结果显示，LPS 诱导的脓毒症急性肺损伤大鼠肺组织AMPK/SIRT1 通路被抑制，而橙花叔醇促进了脓毒症急性肺损伤大鼠肺组织AMPK 的磷酸化并上调了SIRT1的表达。为验证橙花叔醇是否通过介导AMPK/SIRT1通路对脓毒症急性肺损伤产生治疗作用，本研究在同时添加AMPK 抑制剂的条件下使用橙花叔醇预处理模型大鼠，发现橙花叔醇减轻肺损伤的效应被部分逆转，表明橙花叔醇通过激活AMPK/SIRT1通路修护大鼠脓毒症急性肺损伤。

综上所述，橙花叔醇可通过介导AMPK/SIRT1通路及抑制炎症反应对脓毒症急性肺损伤大鼠发挥治疗作用。