南、北五味子对离体大鼠气管平滑肌张力的影响

董 阳,王碧涵,邹一卓,李 婷,孙靖辉,李 贺,陈建光,王春梅

(北华大学药学院,吉林 吉林 132013)

支气管哮喘(简称哮喘)是一种慢性炎症性气管疾病,临床上治疗大部分使用西药,如肾上腺糖皮质激素类药物、肾上腺素受体激动剂等,西药虽然能缓解症状,但长期服用大多会引发不良反应[1-2].因此,迫切需要更加安全和更加有效的哮喘治疗方法.五味子始载于《神农本草经》,具有敛肺、滋肾、生津、收汗、涩精等功效,历代医家均重视其在疾病防治方面的独特运用.王佳然等[3]通过对众多方剂数据深度挖掘与分析,在《中国方剂数据库》中将含有五味子的所有方剂进行了归纳,筛选出600多含有五味子的方剂,在这些方剂中以治疗肺部疾病占大多数,频率高达55%.夏瑜桢等[4]通过对《中医方剂大辞典》、万方数据库等搜索、查阅,对治疗哮喘的中药分布规律进行了研究,明确了五味子在治疗哮喘所用中药中排名靠前.由此可见,五味子在治疗哮喘中占据重要地位.

五味子由于生长区域不同,有南北之分,主要产于东北地区的五味子习惯性称为“北五味子”,主要产于西南地区及长江流域以南地区的五味子习惯性称为“南五味子”.2000年版本的《中华人民共和国药典》对北五味子和南五味子分别进行了收录,并各自制定了相对应的质控标准.2015年版本的《中华人民共和国药典》中记录了因南、北五味子形态、产地不同,成分各有差异,功能主治也各有侧重[5-6].李时珍在《本草纲目》中有“五味子今分南北,南产者色红,北产者色黑,入药补必用北者乃良”.在治疗咳喘症方面,《本草会编》中记载“五味子治喘嗽,须分南北.生津液止渴、润肺、补肾、劳嗽,宜用北者;风寒在肺,宜用南产”[7];《本草备要》记载“北产紫黑者良,入滋补药,蜜浸蒸,入滋嗽药,生用俱褪碎核;南产色红而枯,苦风寒在肺宜南者.从蓉为使,恶萎荻,熬膏良”[8];《本草蒙荃》记载“风寒咳嗽,南五味为奇,虚损劳伤,北五味最妙”[9].由此可见,南、北五味子在哮喘的传统用药上是有差异的.目前,有关于五味子及其有效成分治疗哮喘疾病的药理学基础研究较少,其发挥治疗作用的有效成分和作用机制尚不明确.因此,本研究拟采用现代工艺分离提取南、北五味子木脂素及多糖成分,通过离体实验对比分析南、北五味子不同成分对气管平滑肌张力的影响,揭示其发挥作用的最佳活性部位,为该药治疗肺系疾病的临床应用奠定理论基础.

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验动物

雄性Wistar大鼠(动物许可证编号:SCXK(吉)2018-0007,长春亿斯实验动物技术有限责任公司)40只,体质量250～300 g.大鼠进行分笼饲养,可自由进食饮水,动物用水为生活饮用水,供水方法是由饮水瓶自由摄取,每日一换;更换垫料1～2次/周.试验符合动物实验伦理规定.

1.1.2 试 剂

北五味子(吉林);南五味子(四川);五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素标准品(纯度≥98%,成都普菲德生物技术有限公司);无水乙醇、氯化乙酰胆碱(ACh)、二甲基亚砜(DMSO)、氯化钠(NaCl)、氯化镁(MgCl2)、氯化钾(KCl)、氯化钙(CaCl2)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、葡萄糖(国药集团化学试剂有限公司).

1.1.3 仪 器

HW-1000恒温水浴、JH-2张力换能器、BL-420F生物机能实验系统(泰盟科技有限公司);电子天平(上海精密科学仪器有限公司).

1.2 方 法

1.2.1 五味子木脂素的制备与含量测定

将五味子粉碎后过40目筛,按料液比m∶V=1∶8(g∶mL)的比例加入95%乙醇,加热回流1 h,连续提取两次,合并两次的滤液进行抽滤,将抽滤后的液体进行旋蒸浓缩;加入蒸馏水使乙醇浓度达到70%,放置24 h后再次进行抽滤并旋蒸,然后用大孔吸附树脂进行洗涤,再用95%的乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液进行旋蒸浓缩;最后将浓缩液在水浴锅上加热直至完全无醇味,放入冷冻干燥机中冷冻干燥即得五味子木脂素粗提物[10].

采用HPLC法测定木脂素含量.具体步骤:分别精确称取3 mg五味子酯甲、五味子甲素、五味子醇甲、五味子乙素、五味子醇乙、五味子丙素标准品,用甲醇超声溶解于10 mL容量瓶中,制备标准溶液,4 ℃保存备用;将50 mg木脂素粉末溶解在10 mL容量瓶中,用于制备5 mg/mL的样品储备溶液;取混合标准品及样品储备液各1.5 mL,通过0.45 μm的有机膜注入进样瓶中,放置4 ℃备用,作为待测样品.

检测条件:色谱柱为Waters ODC(上海楚定分析仪器有限公司,250 mm×4.6 mm,5 μm),柱温为30 ℃,检测波长为230 nm.以甲醇(A)-水(B)为流动相进行梯度洗脱,流速为0.5 mL/min,进样量为10 μL.梯度洗脱程序为0～15 min(40%～25%B),16～20 min(25%B),21～30 min(25%～10%B),31～40 min(10%～0B),41～45 min(0B),46～55 min(0～40%B)[11-12].

1.2.2 五味子多糖的制备与含量测定

将五味子粉碎,按料液比m∶V=1∶10(g∶mL)的比例将五味子加入蒸馏水中进行浸泡,24 h后回流提取2次,2.5 h/次;合并溶液后将其抽滤旋蒸浓缩,向浓缩液中加入95%乙醇,使乙醇终浓度为75%,4 ℃静置24 h,抽滤收集沉淀物;依次用95%乙醇和无水乙醇对沉淀物进行洗涤,待醇味挥发后水浴蒸干,得粉末状五味子多糖[13].

采用苯酚-硫酸法测定五味子多糖含量.具体步骤:吸取葡萄糖标准使用液0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL(相当于葡萄糖0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg),置于25 mL比色管中,分别补水至2.0 mL,加入5%苯酚溶液1.0 mL,缓慢加入10 mL浓硫酸,混匀,置沸水浴中煮沸2 min,冷却后测定吸光度值(485 nm);以葡萄糖含量为横坐标、吸光度值为纵坐标,绘制葡萄糖标准曲线;准确吸取五味子多糖溶液2.0 mL,置于25 L比色管中,加入5%苯酚溶液1.0 mL,混匀;小心加入浓硫酸10 mL,在旋转混匀器上小心混匀,置沸水浴中煮沸2 min,冷却至室温;485 nm处测定吸光度值,计算粗多糖含量[14].

1.2.3 大鼠离体气管环的制备

用25%乌来糖(4 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠,将大鼠固定在操作台上,腹面向上,将颈部正中央的表皮剪开,沿甲状软骨底部至气管下部分叉处截取气管;将截取后的气管迅速放入预先配制的4 ℃预冷营养液中,使用手术剪除去气管环周围多余组织后,将气管剪切成长度约2～4 mm的气管环;立即将气管环下端固定在恒温浴槽中,上端固定在张力传感器上,静息张力调节至1.0 g;使气管环在10 mL预热 37 ℃的营养液中平衡60 min,每间隔15 min更换一次预热的营养液,并持续向浴槽内通入混合气体(95%O2和5%CO2)[15];待气管环张力趋于稳定后再进行后续实验.

1.2.4 南、北五味子木脂素和多糖对大鼠气管环张力的直接影响

在大鼠离体气管环张力稳定后,分别累积加入终浓度为0.25～1.75 mg/mL的五味子木脂素溶液和0.06～2.00 mg/mL的五味子多糖溶液,加药后气管环的张力趋于稳定后再加入下一个浓度的药物;实验对照组累计加入相应体积的二甲基亚砜(DMSO)或蒸馏水,记录每一次加药后平稳状态下气管环张力值,并计算抑制率:抑制率=(给药后气管环的张力值-静息状态下的气管环张力值)/静息状态下气管环的张力值×100%.

1.2.5 南、北五味子木脂素和多糖对ACh预收缩气管环张力的影响

在大鼠离体气管环张力稳定后,用1 mmol/L ACh诱导浴槽中的气管环收缩,待气管环收缩幅度趋于平稳时,向浴槽中按浓度递增的顺序累积加入五味子木脂素溶液(0.25～1.75 mg/mL)或五味子多糖溶液(0.06～2.00 mg/mL);实验对照组累积加入相应体积的DMSO或蒸馏水,加药方法同1.2.4,并计算抑制率:抑制率=(ACh刺激气管环所产生的最大收缩张力-加入待测药物后气管环的张力)/(ACh刺激气管环所产生的最大收缩张力-静息状态下的气管环张力)×100%[16-17].

1.2.6 南、北五味子木脂素对KCl预收缩气管环张力的影响

在大鼠离体气管环张力稳定后,用80 mmol/L KCl诱导浴槽中的气管环收缩,待气管环收缩幅度趋于平稳时,向浴槽中按浓度递增的顺序累积加入五味子木脂素溶液(0.06～1.75 mg/mL);对照组累积加入等浓度的DMSO,加药方法同1.2.4,并计算抑制率:抑制率=(KCl诱发气管环的最大收缩张力-加入待测药物后的气管环张力)/(KCl诱发气管环的最大收缩张力-静息状态下气管环张力)×100%.

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 五味子木脂素含量

本研究结果显示,北五味子中6种木脂素总含量为(19.33±0.95)mg/g,南五味子中6种木脂素总含量为(18.63±0.89)mg/g.

2.2 五味子多糖含量

本研究结果显示,北五味子多糖提取率为18.1%,粗多糖含量为20.5 mg/g;南五味子多糖提取率为16.3%,粗多糖含量为19.27 mg/g.

2.3 南、北五味子多糖和木脂素对大鼠气管环静息张力的抑制率

本研究结果显示,南、北五味子多糖对静息状态下离体大鼠气管环的张力无明显影响,与蒸馏水对照组比较差异无统计学意义(P>0.05).见表1.南、北五味子木脂素对静息状态下离体大鼠气管环的张力亦无明显影响,与DMSO对照组比较差异无统计学意义(P>0.05).见表2.提示南、北五味子多糖和木脂素对离体大鼠气管环均无明显的直接作用.

表1 南、北五味子多糖对大鼠气管环静息张力的抑制率Tab.1 Inhibition rate of polysaccharides of southern and northern Schisandra chinensis on resting tension of tracheal rings in rats (n=6)

表2 南、北五味子木脂素对大鼠气管环静息张力的抑制率Tab.2 Inhibition rate of lignans of southern or northern Schisandra chinensis on resting tension of tracheal rings in rats (n=6)

2.4 南、北五味子多糖和木脂素对ACh预收缩气管环张力的抑制率

本研究结果显示,南、北五味子多糖对ACh预收缩气管环张力未见明显影响,与蒸馏水对照组比较差异无统计学意义(P>0.05).见表3.与DMSO对照组比较,南、北五味子木脂素均可显著抑制ACh诱导的气管环收缩(P<0.05),最大抑制率分别为(68.21±10.08)%和(71.72±9.80)%.见表4.提示木脂素可能是南、北五味子发挥平喘作用的主要成分.

表3 南、北五味子多糖对ACh预收缩气管环张力的抑制率Tab.3 Inhibition rate of polysaccharides of southern and northern Schisandra chinensis on tracheal ring tension precontracted by ACh (n=6)

表4 南、北五味子木脂素对ACh预收缩气管环张力的抑制率Tab.4 Inhibition rate of lignans of southern and northern Schisandra chinensis on tracheal ring tension precontracted by ACh (n=6)

2.5 南、北五味子木脂素对KCl预收缩气管环张力的抑制率

本研究结果显示,与DMSO对照组比较,南、北五味子木脂素均可显著抑制KCl诱导的气管环收缩(P<0.05),最大抑制率分别为(79.36±11.66)%和(82.89±11.90)%,提示木脂素可能是南、北五味子发挥平喘作用的主要成分.见表5.

表5 南、北五味子木脂素对KCl预收缩气管环张力的抑制率Tab.5 Inhibition rate of lignans of southern and northern Schisandra chinensis on tracheal ring tension precontracted by KCl (n=6)

3 讨 论

哮喘致病原因比较复杂,目前,世界范围内哮喘病患者已达3亿,中国的哮喘患者已达2 000万,并且哮喘病患者呈现逐年递增的趋势.专家预测,到2025年,世界范围内哮喘病患者将超过4亿[18].五味子是治疗肺系疾病的“要药”,止咳平喘的临床疗效肯定,然而有关其药效物质基础研究较少.所以,探究南、北五味子不同成分的平喘作用、揭示其发挥作用的最佳活性部位具有重要意义.

本研究采用离体灌流方法对大鼠离体气管环张力值的变化进行分析,此方法可直观地根据张力值的变化分析出药物对大鼠离体气管平滑肌张力值的影响.将南、北五味子木脂素和多糖按照浓度由低到高逐次累加到浴槽内作用于离体大鼠气管环,结果表明,处于静息状态下的气管平滑肌的张力值没有显著的变化,提示南、北五味子多糖和木脂素对离体大鼠气管环均无显著的直接作用.大鼠气管平滑肌上存在可以释放乙酰胆碱的胆碱能神经,能使大鼠气管平滑肌趋于静息状态[19].当气管平滑肌细胞膜表面偶联的特异性受体与细胞外的其他生物信号结合后,能够激活相应的信号通路,实现信息的传输,通过信息的传输可以实现气管平滑肌的舒张与收缩[20].气管平滑肌上存在很多特异性与非特异性的受体,其中影响平滑肌舒张与收缩的受体主要是M胆碱能受体与组胺受体,两种受体兴奋状态下会造成气管平滑肌收缩[21].本研究使用M胆碱受体激动剂ACh预收缩气管环,待张力稳定后,将南、北五味子木脂素和多糖按照浓度由低到高的方式逐次累加到浴槽内作用于离体大鼠气管环.结果显示,南、北五味子多糖对Ach诱导的气管环收缩没有明显影响;南、北五味子木脂素可剂量依赖性地抑制由Ach诱导的气管环收缩,从最大抑制率可以看出南、北五味子木脂素对由ACh引起的收缩所产生舒张气管平滑肌作用的强弱无明显差异.

有研究[22-23]显示,高钾可引起细胞膜去极化,并特异性激活电压依赖性钙通道(VDCCs)使细胞外的钙离子内流,引起气管平滑肌收缩.本研究使用KCl预收缩气管环,待张力稳定后,将南、北五味子木脂素按浓度累加方式刺激离体大鼠气管.结果显示,南、北五味子木脂素可剂量依赖性的抑制由KCl诱导的气管环收缩,从最大抑制率可以看出,南、北五味子木脂素对由KCl引起的收缩所产生舒张气管平滑肌作用的强弱无明显差异.

综上所述,南、北五味子木脂素和多糖对离体大鼠气管平滑肌静息张力均未见明显影响;而南、北五味子木脂素对ACh或KCl预收缩的气管环张力均呈现剂量依赖性的抑制作用,但二者之间比较无明显差异,提示木脂素可能是五味子发挥平喘作用的主要成分.有关其舒张气管平滑肌的机制将在后续的工作中进一步深入研究.