拟南芥线粒体蛋白突变体ssr1-2表型的详细鉴定与分析

蔡圆圆 夏季奔奔 应文涵 王洁瑶 谢 涛邢孔丫 冯宣军 华学军

（1.浙江理工大学生命科学与医药学院，杭州 310018；2.四川农业大学，西南作物基因挖掘与利用国家重点实验室，温江 611130）

脯氨酸积累是许多高等植物在各种环境胁迫下体内产生的一种代谢适应机制［1-2］，被认为对胁迫中的植物起保护作用。但在正常生长条件下，无论是转基因导致的体内积累还是体外施加的脯氨酸却对植物生长有抑制作用。过量表达P5CS1的脯氨酸积累的拟南芥（Arabidopsis thaliana）植株的正常生长发育受到了较为严重的抑制，主要表现为花茎的伸长受到的明显的抑制，节间变短，植株明显矮化，但植株开花提前，花期延长，而且抽薹增多，侧生花茎与主花茎长度相仿，成丛生花状［3］。这种表型在过表达P5CS1的其他植物中也不同程度地被观察到。此外，体外施加10 mg脯氨酸就会对拟南芥幼苗的子叶伸展、真叶生长和根的伸长产生抑制作用［4-5］。这种抑制作用可能与脯氨酸本身或其降解产物P5C 有关，同时伴随着活性氧水平的上升，进而导致细胞死亡［6］。

近年来，通过鉴定和分析脯氨酸超敏感和抗性突变体，对脯氨酸毒性的机理有了一些认识。首先，拟南芥中氨基酸通透酶1（AtAAP1）功能缺失能够导致脯氨酸抗性［7-8］。因为AtAAP1位于细胞膜，是脯氨酸进入细胞的重要通道之一，说明脯氨酸对植物生长的抑制作用需要其进入细胞。其次，脯氨酸毒性也与细胞内脯氨酸含量正相关，通过反义RNA敲减或者敲除突变体降低脯氨酸脱氢酶基因（PDH）表达，都会导致植株对脯氨酸超敏感，因为植株体内脯氨酸含量增加［4-5］。也有报道认为，脯氨酸降解的中间产物P5C 可能是脯氨酸毒性的主要原因，因为P5C 脱氢酶基因的突变体p5cdh具有脯氨酸超敏感的表型，在这一突变体中外源脯氨酸处理时体内脯氨酸含量没有显著变化，而P5C 水平显著提高。另一方面，过量表达P5CDH能够降低植株的脯氨酸敏感性［6］。P5C 的毒性也被认为是另一个突变体rsr1-1对脯氨酸超敏感的原因［9］。

脯氨酸积累对正常生长的植株的抑制作用，也限制了其在改良植物抗逆性中的应用［10］。由于脯氨酸合成被认为发生在叶绿体和细胞质中，而脯氨酸降解在线粒体中，因此不论是脯氨酸还是P5C 都有能力在细胞质和细胞器中穿梭。因此它们有可能对不同亚细胞结构的功能都有一定的抑制作用，但目前对于这种抑制作用的确切机制还不清楚。一种普遍的看法是，外源施加较高浓度的脯氨酸会使得植物细胞内的氨基酸水平失衡，导致生长抑制，但这非脯氨酸特异，其他氨基酸的累积也会产生这类毒害［11-12］。这些毒害作用很可能发生在叶绿体和细胞质中。而脯氨酸在线粒体中所起的抑制作用尚不清楚。

在本实验室前期研究中，在拟南芥中鉴定了1个编码1 个具有TPR 结构域的线粒体蛋白基因SSR1。SSR1部分缺失（氮端缺失12 个氨基酸）的突变体ssr1-1对渗透胁迫［13］和外源脯氨酸［14］超敏感。试验结果表明脯氨酸处理后，ssr1-1突变体具有比Col 野生型更高的线粒体活性氧（ROS）水平，更低的ATP 水平和更低的线粒体电子传递链（mETC）复合物Ⅰ和Ⅱ酶活性［14］。这些结果说明，SSR1可能参与维持mETC 正常功能，也暗示正常的mETC能够缓解脯氨酸的毒性。

为了更加准确地了解SSR1的功能，及其与脯氨酸毒性的关系，本研究以SSR1敲除突变体ssr1-2（T-DNA插入在SSR1翻译的起始密码子ATG上游-14碱基对处［13］），及其表型抑制子突变体EMS143和EMS145为材料，对其根和地上部分的生长，及其对脯氨酸的敏感性和铁稳态进行跟踪分析，并利用拟南芥幼苗嫁接技术分析ssr1-2短根表型对地上部分生长的影响，以期为揭示脯氨酸毒性与线粒体功能之间的关系提供一些佐证。

1 材料与方法

1.1 植物材料与培养

拟南芥野生型为Wassilewskija（WS）生态型，突变体ssr1-2（FLAG_356A08，购于Versailles Arabidopsis Stock Center）是WS 背景。互补株系ssr1-2C是ssr1-2转入了WS 野生型的SSR1基因组片段（包含启动子与终止子）［13］、ssr1-2的2个抑制子突变体EMS143和EMS145是从甲磺酸乙酯（EMS）诱变ssr1-2所得的突变体库中筛选到的根长恢复的突变体，背景均为WS。这些株系均为浙江理工大学华学军实验室保有。

1.2 植物材料的种植

拟南芥株系种子的表面消毒和萌发步骤如下：70%乙醇浸泡1 min 后用有效成分0.5%次氯酸钠消毒15 min，无菌水洗涤3～5 次，再用质量分数0.2%琼脂重悬种子，冰箱4 ℃低温处理72 h。将处理好的种子点于Murashige-Skoog（MS）固体培养基（1%蔗糖+2.5 mmol·L-1吗啉乙磺酸+1%～2%琼脂，pH5.8～6.0）上。将培养皿水平（萌发试验）或竖直（根伸长试验）放置在光照培养箱中，培养条件是温度22 ℃、光照强度设置为120 µmol·m-2·s-1、光周期为16 h/8 h（光/暗）。

1.3 突变体表型鉴定

观察并记录5 个株系幼苗从萌发开始1 周内、2 周和3 周时的根长与叶片面积变化，并对已生长2 周的野生型和突变体进行根系发育分析。将培养2周的苗移入土中生长直至第45天时，对5个株系的株高和果荚大小进行拍照测量。用Image J进行分析处理，数据重复测量3次。

1.4 微嫁接试验

微嫁接实验主要参考Tsutsui 等［15］的方法，并进行了必要的改进。在经消毒处理好的种子点于Micrografting chip（购于Bio Medical Science Inc.）并置于含质量分数2%琼脂的MS 培养基上，22 ℃暗培养48 h 后转入连续光培养48 h。第5 天时对幼苗进行切割嫁接，并转入25 ℃连续光培养。嫁接处理6 d 后得到嫁接苗，将其移入含质量分数1%琼脂的MS 培养基在22 ℃，16 h/8 h（光/暗）周期下培养1 周后移入土中，同样条件下继续培养1 周后检测嫁接苗根长和冠幅。嫁接实验共有4种组合，地上/地下分别为：WS/ssr1-2，WS/WS，ssr1-2/ssr1-2和ssr1-2/WS，其中WS/WS，ssr1-2/ssr1-2为对照。

1.5 脯氨酸胁迫处理

在含有15 mmol·L-1脯氨酸的MS 培养基上分别点种经表面消毒处理的上述5个株系的种子，统计1 周内种子萌发率。用含20 mmol·L-1脯氨酸培养基培养1 周的5 个株系拟南芥幼苗，测量各个株系根长、叶片面积并检测叶绿素含量，并与在MS培养下的幼苗进行对比。

1.6 不同铁浓度下的生长检测

不同浓度铁盐处理的试验参考Giehl 等［16］的方法。将经表面消毒的5 个株系的种子点板于不含铁盐的1/2MS 培养基培养4 d 后转入含0、0.05、0.100、0.200、0.500 mmol·L-1FeSO4-EDTA 培养基中继续培养。培养7 d 后，对幼苗进行主侧根长、侧根数量、叶片面积测量记录，并分析计算主根净生长量和侧根密度。同时，收集幼苗检测叶绿素含量。

1.7 叶绿素含量的测量

将待测拟南芥材料称量质量后浸泡于80%丙酮。4 ℃条件下静止48～72 h，直至叶片组织完全无色。紫外分光光度计（UV-2600，上海尤尼柯仪器有限公司）测定提取液在663 nm 和645 nm 波长下的吸光度。根据Han 等［14］方法计算叶绿素a、叶绿素b的总含量。

2 结果与分析

2.1 ssr1-2表型鉴定

为进一步明确SSR1基因在拟南芥生长中的作用，跟踪ssr1-2根表型的形成，对不同生长阶段 的 野 生 型WS 生 态 型、ssr1-2、ssr1-2回 补 株 系ssr1-2C、EMS143和EMS145的 表 型 进 行 了 跟 踪观察。

如图1A 所示，在萌发后第3 天，ssr1-2突变体根长已经明显短于野生型，而回补株系ssr1-2C根长能恢复至野生型。培养至第7 天时这种差别更加显著，同时也可以看到2 个抑制子突变体EMS143和EMS145根长略短于野生型，基本恢复到了野生型水平。各个株系的地上部分的差别并不显著。

据每天跟踪测量结果表明，根长间的差异从萌发后第3天就逐渐显示出来，并随着生长时间的延长，差异不断扩大（图2A）。但地上部叶片面积的变异较为缓慢，在前7 d，野生型与ssr1-2无显著差异（图2B）。培养到第7 天，ssr1-2的叶片面积才略小于野生型，为野生型的93%左右。3 周后，这种差异变得更为明显，但还是远小于两者在根长间的差异。与根长不同，2个抑制子突变体的叶片面积均大于野生型。

为了更好地研究野生型和突变体在根系发育方面的差异，将两者播种于含2%琼脂的MS 培养基上，并竖直培养2周。观察发现，ssr1-2突变体根系的结构与野生型存在显著不同，突变体根基部长出许多类似于须根的侧根，侧根长度与主根长相近，不易区分主侧根。而在同样的生长条件下，野生型主根直长且侧根少。统计结果表明，突变体侧根密度显著大于野生型，平均值为野生型的10 倍，且ssr1-2侧根长/主根长之比平均值为39.93%，而野生型仅为1.83%，两者存在极其显著差异（图1B，图2C，D）。

图1 各株系的生长表型A.WS、ssr1-2、ssr1-2C、EMS143 和EMS145 的5 个株系在MS 培养基上生长3、7 d 的表型；B.WS 与ssr1-2 竖直培养2 周的生长表型；C.各个株系培养45 d后的果荚Fig.1 Phenotype of different linesA.The phenotype of WS，ssr1-2，ssr1-2C，EMS143 and EMS145 grown on MS medium for 3 and 7 d；B.The growth phenotype of WS and ssr1-2 vertically cultured for 2 weeks；C.The siliques of each line grown for 45 d

将幼苗移至营养土中培养45 d 后，ssr1-2株高明显矮于野生型，为野生型的60%左右，EMS143完全恢复至野生型株高，而EMS145略矮于野生型（图2E）。收集45 d时的果荚并测量长、宽发现，突变体ssr1-2的果荚长度短于野生型，而宽度却大于野生型（图1C，图2F，G）。EMS143果荚形状与长宽均与野生型相近，而EMS145果荚长虽略短于野生型，但其宽与突变体相似。

图2 各株系的生长表型对各个株系培养1～7 d、14 d 和21 d 进行根长（A）、叶片面积（B）统计；对2 周苗龄的WS 和ssr1-2 的侧根进行侧根密度（C）、侧根长/主根长比计算（D）；对各个株系培养45 d 后进行株高（E）、果荚长度（F）、果荚宽度（G）统计分析；图中所示为来自至少12株幼苗的平均值与标准差（n≥12）；不同小写字母代表不同株系间差异显著（P＜0.05）Fig.2 Phenotypic analysis of different linesThe statistical analysis of the primary root length（A）and leaf area（B）of each line grown for 1-7 d，14 d and 21 d；The lateral root density（C）and lateral root length/main root length ratio（D）of 2-week-old seedlings of WS and ssr1-2；The heigh（tE），silique length（F），and silique width（G）of each line grown for 45 d；All data were means±SD from at least 12 seedlings；Different lowercase letters represented significant differences among line（sP＜0.05）

2.2 ssr1-2微嫁接

从上面的结果可观察到ssr1-2突变体的地上部分的生长抑制表型出现得晚于根系，加上之前的结果表明，SSR1在根中的表达远高于其他营养器官［13］，故推测地上部分的生长缺陷可能与根短导致的营养成分吸收受阻有关，而并非完全归因于基因敲除。通过对5 d 苗龄的ssr1-2和WS 幼苗进行下胚轴切割并将不同根和地上部分进行嫁接（如图3A所示）以验证假设。

由图3B～C 所示，培养2 周后，ssr1-2/ssr1-2幼苗的根长和冠幅均显著小于WS/WS 幼苗，与正常条件下ssr1-2和WS 幼苗的生长差别情况类似，说明嫁接过程本身并没有改变野生型和突变体幼苗的表型差异。WS/ssr1-2与ssr1-2/ssr1-2幼苗的根都来自ssr1-2，根长无显著差别，前者的冠幅比后者略大，但远小于WS/WS 的冠幅，说明ssr1-2的短根可能限制了WS 野生型地上部分的生长（图3：B，C）。但是从另一方面来看，将ssr1-2地上部分置换于野生型的长根上并不能使得突变体地上表型得到显著恢复（比较ssr1-2/ssr1-2与ssr1-2/WS 的地上部分）。由此推断，ssr1-2突变体地上部分的生长缺陷出现得比根部慢这一现象可能归因于2个原因，即根的营养吸收障碍和SSR1基因突变。

与此同时，也可以发现地上部分对于根的生长有影响。比较ssr1-2/WS 和WS/WS 的根长可以发现，同样是WS 的根，当地上部来自ssr1-2时，根长却只有地上部来自WS 时的1/3 左右（图3C）。但是有意思的是，ssr1-2突变体根的生长则几乎不受地上部分来源的影响，因为ssr1-2/ssr1-2与WS/ssr1-2的根长无明显差别（图3C）。

图3 ssr1-2与WS的微嫁接A.ssr1-2与WS野生型嫁接过程示意图；对生长2周的ssr1-2与WS各嫁接幼苗，进行表型观察并测量主根长（B）和冠幅（C）的测量与统计分析；图中所示为来自至少8株嫁接苗的平均值±标准差（n≥8）；不同字母代表差异显著（P＜0.05）Fig.3 The micrografting between ssr1-2 and WSA.The schematic diagram of micrografting process between ssr1-2 and WS wild type；The seedlings grafted with ssr1-2 and WS for 2 weeks were observed and measured the main root length（B）and crown width（C）were measured and statistically analyzed；All data were mean±SD of at least 8 grafted plantlets；Different letters represented significant differences（P＜0.05）

综上所述，SSR1基因突变对根系和地上部分的功能都有不利影响，根部功能缺陷限制了地上部的生长。而地上部缺陷也在一定程度上影响了根系的生长，但SSR1基因可能在根中的作用更大。

2.3 ssr1-2具有脯氨酸超敏感表型

本实验室曾经报道，SSR1参与维持线粒体功能［14］。SSR1部分缺失突变体ssr1-1具有对脯氨酸超敏感的表型，在含有脯氨酸的培养基上，ssr1-1的根伸长和地上部分生长的受到更加严重的抑制。初步结果表明，SSR1敲除突变体也具有脯氨酸超敏感性［14］。为了进一步确定ssr1-2的脯氨酸超敏感性，本研究同时引入了ssr1-2的遗传互补株系（ssr1-2C）和抑制子突变体株系这些遗传材料。

首先，对各个株系在施加脯氨酸的条件下的相对萌发率（萌发率proline/萌发率MS）进行比较发现，在15 mmol·L-1脯氨酸处理下第1 天，野生型和回补株系的相对萌发率分别为74%和79%左右，ssr1-2的萌发率最低，仅为正常条件下的31%，即萌发最慢，说明ssr1-2对脯氨酸最敏感。而2 个抑制子突变体均恢复了对脯氨酸的抗性，尤其是EMS145第1天相对萌发率为108.50%（表1）。

表1 外源性脯氨酸下各株系种子相对萌发率Table 1 Effect of exogenous proline on the relative germination rate of different lines

在含20 mmol·L-1脯氨酸的培养基中培养1 周后，各个株系生长情况均受到明显的抑制，表现为根短、叶片萎蔫和黄化（图4）。其中ssr1-2、EMS143和EMS145根长的相对生长受脯氨酸抑制程度明显大于野生型和ssr1-2C，其中又以EMS143和EMS145两者为甚，根长仅为对照的21%（表2）。这一结果说明，ssr1-2根的伸长对脯氨酸也表现出超敏感，2个抑制子突变体的根长虽然在正常条件下恢复至野生型水平，但在脯氨酸处理情况下根长并没有恢复，反而有所加剧。

图4 不同浓度脯氨酸下各株系幼苗生长表型WS野生型、ssr1-2、ssr1-2C、EMS143和EMS145株系在含不同浓度脯氨酸的培养基上培养7 d后的表型Fig.4 The phenotypes of seedling grown in different exogenous proline conditionThe phenotypes of WS，ssr1-2，ssr1-2C，EMS143 and EMS145 lines which were grown in MS medium containing different concentration of proline for 7 d

从叶片面积来看（表2），20 mmol·L-1脯氨酸处理下，各个株系叶片面积的相对变化差别不大（小于根长的相对变化），但还是可以看出ssr1-2叶片面积的相对生长比较低，在ssr1-2C中又恢复到了野生型的水平，这也说明ssr1-2对脯氨酸超敏感。有所不同的是，抑制子EMS143叶片生长受脯氨酸影响程度与突变体相近，而在EMS145中，叶片面积的相对生长得到了很好的恢复，甚至超出了野生型。

表2 外源性脯氨酸对各株系生长的影响Table 2 Effect of exogenous proline on growth of different lines

关于地上部分的另一个生理指标叶绿素含量的检测结果表明（表2），在20 mmol·L-1脯氨酸处理下，ssr1-2的相对叶绿素含量明显低于野生型WS 和回补株系ssr1-2C，再次说明ssr1-2对脯氨酸超敏感。抑制子突变体EMS143和EMS145在正常条件下的叶绿素含量虽略低于野生型，但其叶绿素含量受脯氨酸处理的影响程度却小于野生型，尤其是EMS145受脯氨酸影响程度远小于其他4个株系。这一结果也说明了ssr1-2叶片失绿的表型在抑制子突变体中得到了恢复。

综上所述，ssr1-2对脯氨酸超敏感。而2 个抑制子突变体虽然很大程度上恢复了ssr1-2在正常生长条件下的根长，但是根伸长对脯氨酸超敏感这一表型却未得到完全恢复，暗示SSR1介导根生长和脯氨酸抗性可能是通过不同机制实现的。

2.4 ssr1-2适应于缺铁和过量铁环境

通过对ssr1-1的研究，前期结果表明SSR1能够影响胁迫下植株内铁代谢相关基因的表达、铁含量和线粒体中一些铁硫蛋白的活性，说明SSR1在细胞内铁稳态的维持方面起着一定的作用［14］。

为了获得更多这方面的证据，对上述5个株系在不同铁盐浓度下培养的生长情况进行观测。其中在MS 培养基中，铁盐的浓度是0.1 mmol·L-1，是大多数植物的最佳铁盐浓度。实验结果也显示大部分根系相关的指标在0.05和0.10 mmol·L-1Fe条件下表现最好（如主、侧根长和主根净伸长，表3），而叶相关的指标随不同铁浓度的变化则不明显（如叶片面积和叶绿素含量，表3）。在不加Fe 条件下所有株系的大部分生长指标，如主侧根长、生长量、叶绿素含量等均受到很大程度的抑制。但随着铁浓度的增加，这些指标在WS、EMS143、EMS145和ssr1-2C都有不同程度的提高。而有趣的是，ssr1-2中主、侧根长对铁浓度变化不敏感，始终保持低水平。这一结果说明SSR1基因能够介导铁对根长的促进作用，符合其可能参与铁硫簇合成的假说。2个抑制子突变体在主、侧根长铁响应方面的恢复程度有所区别。就主根长而言，EMS143基本得到恢复（达到WS 野生型水平），而EMS145则恢复了约50%。在侧根长方面，两者均完全恢复。

表3 外源性铁盐对各株系生长的影响Table 3 The effect of iron concentration on growth of different lines

此外，统计上述5 个株系的侧根密度，即单位长度主根上侧根的数量（表3）发现，WS 和ssr1-2C中各浓度铁处理显著地抑制侧根密度，而ssr1-2中则没有表现出这种抑制，并且在各个铁浓度下均显示出最大的侧根密度。反应了其须根特性以及对铁处理的不敏感。2 个抑制子突变体的侧根密度随着铁浓度的增加变化不明显，均小于ssr1-2。这些结果说明，SSR1在拟南芥根系正常形态的维持上起着重要的作用，其突变之后导致侧根密度加大，并对铁使侧根密度减小的作用不敏感。

与此同时，也对地上部分对铁的响应（叶片面积和叶绿素含量）进行了检测。如图5F所示，WS、ssr1-2和ssr1-2C的叶片面积基本不受铁浓度的影响。在各种铁浓度下，ssr1-2的叶片面积略小于WS和ssr1-2C，与前面提到的ssr1-2矮小表型一致。EMS143和EMS145叶片面积在不添加Fe时是所有株系中最小的2个，但在加铁的情况下有所恢复。

图5 不同浓度铁盐下各株系生表型Fig.5 The phenotypes of seedling growth of iron concentration

各个株系在缺铁的情况下，叶绿素含量都比较低。在加铁的条件下，它们叶绿素含量不出意料地显著上升，毕竟叶绿素合成需要铁。也说明SSR1缺失导致铁响应变化不包括叶绿体的合成，可能是因为SSR1 定位于线粒体，更多地影响线粒体相关的功能。值得一提的是，ssr1-2在缺铁条件下叶片叶绿素含量显著高于WS，而EMS143和EMS145则低于WS。

3 讨论与结论

胞内积累过量脯氨酸所导致的对植物正常生长的抑制，有时称为脯氨酸毒性，是脯氨酸积累作为植物抗逆育种手段的主要制约因素［10］。因此，深入了解脯氨酸毒性的靶标及其分子机理，有利于更好地利用这一植物胁迫适应机制来培育抗逆作物品种。长期以来脯氨酸分解代谢被认为与线粒体电子传递链有关联［17］，并且研究发现在动物细胞线粒体内NADPH 主要生理功能是去促进脯氨酸的生物合成［18-19］，进一步说明线粒体功能与脯氨酸代谢之间有着重要的联系。但在植物中尚无这方面的遗传学证据。

Han 等［14］曾经报道植物特有基因SSR1编码1个线粒体蛋白，可能在维持mETC 活性中发挥功能，其部分缺失突变体ssr1-1对脯氨酸毒性超敏感。为了更好地探索SSR1在线粒体中的功能，以及脯氨酸毒性与线粒体功能之间的关系，本研究对SSR1敲除突变体ssr1-2的脯氨酸敏感性和铁营养的利用等方面进行了详细鉴定。

本研究对ssr1-2进行了表型跟踪鉴定，发现在正常生长条件下ssr1-2根长和冠幅均显著小于野生型，但短根的表型出现早于地上部分的表型。结合之前的SSR1转录本在根中远高于叶片中的结果，故推测SSR1在根中的作用大于叶中的。为了区分ssr1-2地上部分矮小是SSR1缺失直接导致的，还是由于短根所引起的营养不良导致，通过微嫁接技术对突变体和野生型进行上下部分交换。结果发现，ssr1-2的短根使得WS地上部分变小，而WS 的正常根则能部分恢复ssr1-2的地上部分（图3：B，C），说明短根确实影响了地上部的生长，可能是短根在吸收营养方面有所欠缺所导致。同时SSR1缺失也的确影响了植株地上部分的生长。此外发现ssr1-2的地上部分能够反过来抑制WS的根的伸长，但是WS 的地上部分却不能增加ssr1-2的根长（图3C）。这可能是ssr1-2地上部生长素的合成或者运输减弱了［13］，无法正常输送生长素到根部。

脯氨酸敏感性分析结果表明，相比于野生型WS，ssr1-2在种子萌发、主根生长和叶绿素含量等指标上表现出脯氨酸超敏感。而叶片面积上则无显著差别，也可能是培养时间不够长，差别尚未显示出来的缘故。而这一超敏感性在互补株系（ssr1-2C）中得到了恢复，说明ssr1-2所表现出的脯氨酸超敏感表型的确由SSR1突变引起的，即SSR1具有维持对脯氨酸抗性的功能。抑制子突变体EMS143和EMS145正常条件下的根长基本恢复到了WS 野生型水平（图2D，表2），但根长对脯氨酸的敏感性则并未得到恢复，反而变得更加敏感。这些结果表明，抑制子突变体并不足以抑制ssr1-2在所有生长条件下的表型，在由脯氨酸处理引起的线粒体胁迫条件下则不能恢复生长缺陷。且2个抑制子突变体在脯氨酸处理条件下恢复情况有所不同，这可能是与2个抑制子基因在线粒体铁硫簇合成过程中发挥功能的重要性有关。

铁是植物生长所必需的营养元素，例如，它是合成铁硫簇的原料，也是叶绿素合成所必需的。Han等［14］曾经报道，ssr1-1在脯氨酸处理下，胞内铁含量、一些线粒体铁硫蛋白的活性显著低于野生型，说明SSR1参与胞内铁平衡和铁硫蛋白活性的维持。在本研究中进一步研究了ssr1-2对外加铁营养的响应。多项生长指标检测结果表明，ssr1-2对铁营养的响应大大减弱。这与笔者的抑制子鉴定结果相吻合，即ssr1-2短根表型能够被2 个编码线粒体铁硫簇合成相关蛋白的基因所发生的功能获得性突变所抑制，而铁硫簇合成是铁营养利用的主要途径。因此，笔者推测ssr1-2的脯氨酸超敏感表型的出现可能是由于线粒体铁硫簇供应不足，致使mETC 中重要的铁硫蛋白活性下降导致的，脯氨酸降解为mETC 提供电子无法完全消化，最终导致电子溢出引起线粒体内活性氧水平上升，从而抑制植物的生长发育［20］。但具体的分子机理还有待于进一步阐明。

铁对叶绿素合成是必需的。在缺铁情况下，各个株系的叶绿素水平都较低，导致植株叶片黄色化。而不同的铁浓度，都能增加叶绿素含量，有意思的是，ssr1-2的叶绿体含量对铁还是有响应的，虽然响应有所降低（表3）。这可能是因为SSR1 为线粒体蛋白，所以特异地在线粒体而不在叶绿体中起作用。

本研究结果表明，SSR1可能通过影响铁营养利用参与了对拟南芥根生长的调控，暗示线粒体铁利用机制的损伤可能是对脯氨酸毒性敏感性增强的原因之一。这些结果将为进一步深入阐明SSR1在线粒体中的功能提供了可靠的依据。