羊草WRKY40的克隆及其转基因烟草抗病性分析

李丹妮 刘佳丽 张继涛 顾宝祥 朱凤金 管清杰*

（1.东北盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室，东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040；2.中国科学院东北地理与农业生态研究所，长春 130000）

水稻（Oryza sativa）是世界上最重要的粮食作物之一，白叶枯病菌（Xanthomonas oryzaepv.Oryzae）［1］、纹枯病菌（Rhizoctonia solani）［2］、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）［3］、恶苗病菌（Fusarium fujikuroi）［4］对水稻的侵害已严重影响水稻的生长发育。当前研究表明化学药剂、栽培措施等防治效果不佳，因此挖掘抗病基因以及研究抗性机制成为选育抗病品种的重要途径。

尽管目前对水稻抗病机制尚不明确，但对拟南芥（Arabidopsis thaliana）等模式植物的抗逆反应机制的研究表明，植物中的WRKY 蛋白在调节非生物胁迫反应以及信号转导中发挥重要作用，例如WRKY基因参与抵御干旱胁迫、盐胁迫、冷胁迫、病害胁迫等非生物胁迫反应［5-6］。其中AtWRKY40参与拟南芥干旱胁迫响应过程［7］、MsWRKY11基因可以提高紫花苜蓿（Campylotropis polyantha）的耐盐能力［8］、PtrWRKY40能够提高毛果 杨（Populus trichocarpa）的 抗 旱 能 力［9］、Pm-WRKY40在梅花（Prunus mume）抵御低温胁迫中发挥重要作用［10］。

WRKY 家族是整个绿色谱系高等植物中最大的转录因子家族［11］，在植物抗病反应的信号途径调控中也扮演重要角色［12］。谷子（Setaria italica）WRKY 转录因子响应白发病菌（Sclerospora graminicola）胁迫［13］、GhWRKY22基因正调控棉花对黄萎病（verticillium wilt）的抗性［14］。WRKY TFs在抗病胁迫中可以作为不同压力介导的信号通路节点。CmWRKY15-1 可通过水杨酸信号通路，而正向调控菊花（Dendranthema morifolium）的白色锈病（Albugo portulacae）抗性［15］。在Xa21 介导的抗白叶枯病响应中，OsWRKY68 发挥正调控作用［16］。WRKY40 转录因子在调控病害胁迫的信号通路中发挥关键作用。MdWRKY40 介导提高苹果（Malus pumila）与拟南芥对轮纹病菌（Physalospora piricola）的免疫抗性，调节植物根系生长发育功能［17］。OsWRKY40 和52 可能参与到Xa21 介导的抗白叶枯病途径中发挥作用［18］。

目前羊草（Leymus chinensis）是畜牧业中优质饲料资源，是中国内蒙古东部、东北平原等草地的重要优势建群种，其根系横竖交织形成的根网，可抵御植物的根入侵［19-20］，同时羊草自身的抗病基因也会提高其他作物对病害的耐受性［21］。

本研究以羊草为材料筛选抗病基因来提高水稻的抗病害能力，而WRKY 转录因子在抗病胁迫中可以作为信号通路节点，因此选择从羊草中克隆WRKY40 作为研究对象；以RT-PCR 方法克隆LcWRKY40基因并进行生物信息学分析，明确Lc-WRKY40 蛋白在亚细胞发挥功能的场所，以及在羊草不同组织器官中的表达特异性；通过农杆菌转化法获得异源表达LcWRKY40转基因烟草，并利用注射接菌烟草叶片的试验法验证LcWRKY40基因与抗病性的相关性，旨在探究羊草LcWRKY40的功能，并为后续作用机制的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

羊草种子（采收于安达市东北林业大学野外试验田）、本氏烟草由东北林业大学（东北盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室）保存。

1.1.2 菌株与载体

大肠杆菌（Escherichia coli）JM109、根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105、pCXSN植物表达载体、pBI121∶∶GFP植物荧光表达载体由本实验室储存。pMD18-Tvector 购于TaKaRa公司。水稻白叶枯病菌、水稻恶苗病菌、水稻纹枯病菌和水稻稻瘟病菌由吉林省农业科学院王继春课题组提供。

1.1.3 试剂

2×Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix、2×Ex-TaqDNA 聚合酶、RNA 提取试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购于北京康为世纪公司，其他所用试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 试验方法

1.2.1 羊草总RNA的提取以及cDNA的合成

运用北京康为世纪公司的RNA提取试剂盒提取羊草叶片的总RNA。运用北佳生物反转录试剂盒，制备cDNA反转录产物20 µL。

1.2.2LcWRKY40全长序列克隆

以LcWRKY40（登录号：MN187915）的CDS 序列设计特异性引物（见表1），以羊草cDNA 为模板，用RT-PCR 扩增LcWRKY40的全长序列，使用OMEGA 胶回收试剂盒回收PCR 产物，连接pMD18-T 载体后热激转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞，在氨苄青霉素的抗性筛选培养基上过夜培养，选取阳性克隆培养，应用北京康为世纪公司质粒小提试剂盒提取质粒后送到库美公司测序。

表1 LcWRKY40基因引物Table 1 Primer sequences of LcWRKY40

1.2.3LcWRKY40生物信息学和进化树分析

在NCBI（blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在线网站上通过BLAST 对LcWRKY40基因进行同源性分析比对；NCBI ORF Finder（www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）分析开放阅读框；通过MEGA 7.0软件制作LcWRKY40 蛋白的系统进化树；使用在线网站WebLogo（http：//weblogo.threeplusone.com/create.cgi）对LcWRKY40 蛋白保守结构域进行分析并作图；利用在线网站Hum-mPLoc3.0（Hum-mPLoc 3.0 server（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Hum-mPLoc3/））预测LcWRKY40的亚细胞定位。

1.2.4 LcWRKY40蛋白的亚细胞定位

根据LcWRKY40基因序列全长设计特异性引物（见表1），以pMD18-T-LcWRKY40质粒为模板进行PCR 反应，将回收反应产物与经XbaⅠ和SalⅠ酶切后的pBI121：：GFP载体进行连接，获得重组表达载体pBI121：：LcWRKY40：：GFP。利用电击法将重组载体和空载体转入农杆菌，利用农杆菌注射方法将其注入到烟草背面，暗培养48 h。通过激光共聚焦荧光显微镜（Olympus Imager.Z2，日本）观测LcWRKY40蛋白亚细胞定位。

1.2.5LcWRKY40组织器官的表达模式分析

对安达市东北林业大学野外试验田长势基本一致的羊草植株根、茎、叶、叶鞘、稃和花药组织部位取样，提取总RNA。将1 µg 总RNA 作为模板反转录成cDNA。选用羊草LcActin为内参基因，进行qRT-PCR 分析。用MxPro-Mx3000P 系统进行试验操作，每个试验样品分别进行3 次技术重复和3 次生物学重复。

1.2.6LcWRKY40转基因烟草的获得

构建植物表达载体pCXSN：：LcWRKY40，利用农杆菌转化法转化野生型本氏烟草植株，将浸泡过农杆菌液的烟草叶片置于共培养培养基（MS+As）上暗培养3 d后，再换分化培养基培养至植株。将得到的T0代种子播种于含有25 mg·L-1Hyg 的1/2MS 培养基筛选。观察在潮霉素筛选下烟草的生长情况，选取转化株系和对照株系提取基因组DNA，利用LcWRKY40-F2、LcWRKY40-R2 进行过表达植株的分子鉴定。

1.2.7LcWRKY40转基因烟草株系相对表达量分析

分别取生长到四叶期的野生型烟草（WT）和LcWRKY40转基因烟草株系（#1，#2，#3，#4），分别提取植株总RNA 后，反转录成cDNA。以cDNA 为模板，LcActin为内参基因，进行荧光定量PCR 试验，检测其相对表达量。用MxPro-Mx3000P 系统进行试验操作，每个试验样品分别进行3次技术重复和3次生物学重复。

1.2.8LcWRKY40转基因烟草的抗病性分析

将水稻植株病害和健康的交界处表面消毒后，剪切置于PDA 培养基分离纯化，得到4 种病菌：水稻白叶枯病菌、水稻恶苗病菌、水稻纹枯病菌和水稻稻瘟病菌。将病菌注射进野生型烟草和转基因烟草第3 枚叶片后观察培养，并将第3 枚叶片临近表型相似的叶片剪下作为处理前对照。将通过摄影生物显微镜（Olympus-SZX-FOF，日本）测量的叶片病菌侵蚀面积作为鉴定其抗病能力的依据。

2 结果与分析

2.1 LcWRKY40基因克隆与生物信息学分析

2.1.1 羊草叶片总RNA 的提取及LcWRKY40基因的克隆

提取羊草叶片的总RNA（见图1A），将其反转录成cDNA。对LcWRKY40目的基因进行PCR 扩增，目的基因条带在1 000 bp 偏上的位置（见图1B）回收DNA 片段连接插入pMD18-T 载体，质粒pMD18-T-LcWRKY40送样测序正确。

图1 羊草叶片总RNA的提取及LcWRKY40基因的克隆A.羊草叶片总RNA电泳检测；B.PCR 扩增目的基因（M.DNA Marker；1.LcWRKY40目的基因）Fig.1 Extraction of Total RNA from Leymus chinensis leaves and cloning of LcWRKY40 GeneA.Electrophoretic detection of total RNA of Leymus chinensis leaves；B.PCR amplification of target genes（M.DNA Marker；1.LcWRKY40 target gene）

2.1.2LcWRKY40基因生物信息学分析

通过运用NCBI 在线网站比对分析，显示Lc-WRKY40基因全长1 791 bp，5′端非编码区长度是313 bp，3′端非编码区长度是425 bp，ORF 区域长度为1 053 bp，编码350个氨基酸，蛋白分子质量为38.1 kDa。WebLogo 预测结果显示LcWRKY40 蛋白有WRKYGQK 结构域以及锌指蛋白结构域（218～250 bp），并含有SRKRKS 核定位序列（见图2A）。构建LcWRKY40 蛋白（登录号：QIG37591）进化树后发现，LcWRKY40 蛋白和HvWRKY38 亲缘关系接近（见图2B），并对其保守结构域序列比对分析的结果显示其锌指蛋白结构序列为C-X5-C-X23-H-X-H（见图2A）。利用在线网站Hum-mPLoc3.0 预测LcWRKY40 蛋白定位于细胞核中发挥特定功能（见图2C）。

图2 LcWRKY40基因生物信息学分析A.不同物种WRKY 转录因子同源序列比对（左侧黑色序列部分为WRKY 基序与右侧C2H2 锌指蛋白保守序列）；B.LcWRKY40 蛋白系统进化树；C.LcWRKY40蛋白亚细胞定位预测Fig.2 The bioinformatics analysis of LcWRKY40 geneA.WRKY transcription factor of different species homologous sequence alignmen（tThe left black sequence is WRKY motif and the right C2H2 zinc finger protein conserved sequence）；B.The phylogenetic tree of LcWRKY40 protein；C.The prediction of LcWRKY40 protein subcellular localization

2.2 LcWRKY40蛋白亚细胞定位分析

通过酶切连接构建pBI121：：LcWRKY40：：GFP重组表达载体，在根癌农杆菌的介导下，通过烟草注射法进行亚细胞定位分析，显微镜检测到绿色荧光蛋白发光信号，DPAI 细胞核染色，二者重合（见图3），结果说明LcWRKY40蛋白在细胞核发挥转录因子的作用。

图3 烟草细胞中LcWRKY40蛋白的亚细胞定位35s：：GFP为对照组；35s：：LcWRKY40：：GFP为实验组Fig.3 Subcellular localization of LcWRKY40 protein in tobacco cells35s：：GFP as a control group；35s：：LcWRKY40：：GFP as the experimental group

2.3 LcWRKY40 基因时间和空间的表达特性分析

通过分析实时荧光定量PCR 数据发现Lc-WRKY40基因在羊草不同生长期的组织器官的差异表达特性。LcWRKY40基因在羊草的根、茎、叶、叶鞘、稃、花药中均会表达，并且表达量在叶中达到最高，在稃中最低（见图4）。

图4 LcWRKY40基因组织器官表达特性分析误差线代表3个生物学重复的标准差；下同Fig.4 Analysis on the expression characteristics of LcWRKY40 geneError lines represented standard errors for three biological replicates；the same as below

2.4 pCXSN：：LcWRKY40 的构建及转基因烟草的筛选鉴定

2.4.1 植物表达载体pCXSN：：LcWRKY40的鉴定

应用LcWRKY40-F2 和R2 引物扩增获得的ORF 基因片段与植物表达载体pCXSN 连接，通过BamHⅠ酶切鉴定重组质粒，经1%凝胶电泳后，目的条带大小与预期相符，表明pCXSN：：LcWRKY40载体构建成功（见图5A），电击转化到根癌农杆菌。

2.4.2 过表达LcWRKY40烟草分子鉴定及筛选

载体构建成功（见图5A），以电击转化将pCXSN：：LcWRKY40导入根癌农杆菌，侵染本氏烟草，筛选到T0 代抗性转化子，再使用潮霉素筛选Lc-WRKY40转基因烟草种子（图5B）。以其幼叶中提取的DNA 为模板、LcWRKY40-F2、LcWRKY40-R2 为引物、并以pCXSN：：LcWRKY40质粒和野生型烟草DNA 分别做阳性、阴性对照，进行过表达植株的PCR鉴定（图5C），结果获得转基因株系，移栽花盆中培养。

图5 LcWRKY40过表达烟草的分子鉴定及筛选A.pCXSN：：LcWRKY40 酶切鉴定（M.DNA Marker；1.pCXSN：：LcWRKY40 重组载体酶切片段）；B.过表达LcWRKY40 烟草转化苗的潮霉素抗性筛选（WT.野生型；#1～#3.3个T0代的不同转基因株系）；C.转基因植株PCR鉴定（M.DNA Marker；CK+、CK-分别为阳性对照和阴性对照；#1～#4.4个T0代的不同转基因株系）Fig.5 Molecular identification and screening of Tobacco with LcWRKY40 overexpressionA.The Enzyme digestion identification pCXSN：：LcWRKY40（M.DNA Marker；1.Enzyme digestion of pCXSN：：LcWRKY40 recombinant vector）；B.Screening of hygromycin resistance of transgenic tobacco seedlings with overexpression of LcWRKY40 gene（WT.Wild type；#1-#3.Three different transgenic lines of T0 generation）；C.PCR identification of transgenic plants（M.DNA Marker；CK+ and CK-were positive control and negative control respectively；#1-#4.Four different transgenic lines of T0 generation）

2.4.3LcWRKY40转基因烟草株系相对表达量分析

在经过筛选后的T1 代阳性植株中，提取植株RNA，将其反转录成cDNA，进行qRT-PCR分析，结果显示：LcWRKY40转基因烟草株系#1、#2、#3、#4表达量明显高于野生型（见图6），可进行后期抗性胁迫试验。

图6 LcWRKY40 转基因烟草相对表达量WT.野生型植株；#1～#4.转基因植株Fig.6 Analysis of relative expression of LcWRKY40 in transgenic tobaccoWT.Wild-type plant；#1-#4.Transgenic plant

2.5 LcWRKY40转基因烟草抗病性分析

以病菌接种烟草叶片的损伤面积、萎蔫程度及注射前后烟草叶片的生长状态作为评价烟草抗病性的依据（图7A）。无论是野生型烟草还是转基因烟草对水稻白叶枯病菌均不敏感，阳性烟草反而不如野生型烟草对水稻纹枯病耐受，而注射水稻稻瘟病菌的野生型烟草损伤面积是同样注射水稻瘟病菌的转基因烟草损伤面积的3.5 倍（图7B）。注射水稻恶苗病菌的野生型烟草出现萎蔫、黄化甚至腐烂的现象，而转基因烟草无腐烂情况，并对水稻恶苗病菌的侵害表现出极大的缓解作用。注射水稻恶苗病菌的野生型烟草损伤面积是转基因烟草损伤面积的1.5 倍（图7B）。以上说明LcWRKY40转基因烟草对水稻稻瘟病菌、水稻恶苗病菌具有极高的抗病性，LcWRKY40可能参与稻瘟病和恶苗病的抗性调节。

图7 LcWRKY40转基因烟草抗病性分析A.野生型烟草和转基因烟草抗病性表型差异；B.野生型和转基因烟草接种病菌后损伤面积的差异；***.WT 株系与T3 代转基因株系差异显著（P＜0.001）Fig.7 The extraction of total RNA from Leymus chinensis leaves and cloning of LcWRKY40 geneA.Phenotypic difference of disease resistance between wild-type and transgenic tobacco；B.Difference in damage area between wild-type and transgenic tobacco inoculated with bacteria；***.There were significant differences between WT lines and T3 transgenic line（sP＜0.001）

3 讨论与结论

目前鉴定抗病基因并培育抗病水稻品种是根治水稻病害的最佳方案［22］。据报道羊草自身基因可提高作物对病害的耐受性，而植物种特有的WRKY 转录因子可通过调节信号通路来提高植物抗病性［23］。

本研究在羊草叶片中克隆得到LcWRKY40基因，羊草不同组织器官表达分析显示LcWRKY40基因主要在叶片中表达，而转基因叶片接菌后，转基因株系的生长速度快于野生型，推测该基因可能参与病害胁迫下叶片生长发育的调控［24］。LcWRKY40 蛋 白 结 构 分 析 显 示 存 在WRKYGQK 结构域和包含C2H2 锌指蛋白保守序列的转录调节因子，推测与真核生物的生长发育及逆境胁迫的耐受能力都有着重要关系［25］。本研究通过pBI121：：LcWRKY40：：GFP融合表达载体的亚细胞定位实验验证了LcWRKY40 蛋白定位于细胞核，推测其可能参与细胞信号分子的调控。构建LcWRKY40 蛋白系统进化树发现，LcWRKY40 蛋白与BdWRKY（二穗短柄草Brachypodium distachyon）具 有 同 源 性，而BdWRKY 对调节小麦抗病害中具有关键调节作用［26］。在含pCXSN：：LcWRKY40农杆菌介导下侵染获得异源表达的LcWRKY40转基因烟草植株，为后续抗病害胁迫奠定实验基础。通过注射法接种水稻白叶枯病菌、水稻纹枯病菌、水稻稻瘟病菌、水稻恶苗病菌于烟草叶片的实验结果表明：LcWRKY40转基因烟草株系对水稻稻瘟病菌、水稻恶苗病菌具有极高的抗病性。推测WRKY40 转录因子可能作为病菌胁迫介导的信号通路的节点，与CaWRKY40 受水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）和乙烯（ET）信号传导的调节，并协调对青枯菌侵袭的热激响应相类似［27］。

本研究克隆到LcWRKY40基因，并检测到抗病性调节，为揭示LcWRKY40基因参与植物对稻瘟病和恶苗病抗性调节的作用进行初步探索，为将来水稻抗病性育种提供了基因资源，也为探索异源表达提高水稻抗逆性奠定了分子基础。