PsnHB13与PsnHB15在小黑杨中的遗传转化与功能分析

郑占敏 商玉冰 周广波 肖 迪 刘 轶 由香玲

（1.莘县国有马西林场，聊城 252400；2.国家林业和草原局重点国有林区森林资源监测中心，加格达奇 165000；3.林木遗传育种全国重点实验室（东北林业大学），哈尔滨 150040；4.东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040）

灵活精确地控制细胞分裂和分化是高等植物器官进化的关键因素。为了了解植物的生长规律，有必要揭示细胞周期与生长调节之间的关系。G1/S 边界是细胞周期过程的关键开关，在动物和植物之间功能保守，属D 型细胞周期蛋白（CYCD）通路［1-2］。CYCD是G1阶段的限速组件［1］。植物中，在蔗糖和植物激素的协同调控下，细胞分裂过程的G1期受到CYCDs 表达水平和活性的强烈影响［3-5］。小黑杨（Populus simonii × P.nigra）的CYCD家族基因PsnCYCD1；1在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中过表达可促进细胞分裂并导致小细胞生成和细胞分裂素反应，导致叶片弯曲和花序茎扭曲。此外，在PsnCYCD1；1过表达植株中，内源基因如ASs、KNATs、EXP10和PHB的转录水平显著上调［6］。在小黑杨中过表达PsnCycD1；1出现分生组织发育异常、细胞壁变厚、叶芽及弯曲处两侧次生木质部分化出现异常，导致茎干偏心生长等表型［7］。

同源异型域—亮氨酸拉链（HD-Zip）蛋白为植物中所独有的一类转录因子，包含序列高度保守的同源异型结构域（HD）和亮氨酸拉链结构域（LZ）2 个重要的元件，具有结合特异DNA 的活性并控制其转录的能力［8-10］。PsnHomeobox 13（Psn-HB13）是HD-ZIP Ⅰ亚家族的成员之一，结合己有的研究，提出了该亚家族蛋白的结构模型：除具有HD-ZIP 结构域外，还具有酸性环境中嵌入的大疏水氨基酸残基结构域（AHA motif）以及羧基末端结构域（CRT motif）和氨基末端结构域（NRT motif）。HD-ZIP 结构域可以结合DNA 并二聚体化，AHA 结构域具有激活转录的作用，而CRT 与NRT区域的保守结构域则控制磷酸化与泛素化对转录激活功能从而进行调控［11］。该亚家族已被鉴定可以调节植物维管组织以及毛状体的发育，介导信号转到、逆境胁迫应答，对于叶片、种子发育、茎的生长等方面也发挥着重要的作用，每一个基因的异位表达都会产生不同的表型［12-16］。本课题组前期研究发现，异源过表达PsnHB13的烟草（Nicotiana tabacum）出现叶面积变小、叶型变长，根系生长缓慢，花朵变小等明显表型［17］。说明PsnHB13基因主要对烟草叶片、根系及花的生长发育起到负调控作用。

PsnHomeobox 15（PsnHB15）是HD-Zip IIII 亚家族的成员之一，该亚家族的结构复杂，除具有HD 和ZIP 结构域外，从N 端到C 端还含有START（steroidogenic acute regulatatory protein lipid transfer domain）、HD-SAD（homeodomain START associated domain）和MEKHLA（Met-Glu-Lys-His-Leu-Ala）结构域。START结构域约有200个氨基酸，可以结合疏水小分子，如固醇类、类胡萝卜素以及磷脂等，该结构在动物体内的研究己经较为透彻，START 结合胆固醇将其从线粒体膜内运到膜外，MEKHLA 结构域与细菌、绿藻的MEKHLA 蛋白同源性较高，所以该结构域可能与接收光信号调控有关［18-20］。HD-ZIP Ⅲ类基因起初在苔藓类植物的单倍世代区域表达，这类基因的原始功能并不包含器官的极性调控、分生组织的调控以及维管组织的发育，随着植物的进化和对环境的适应，该类基因的功能也随之多样化，在陆生植物中参与维管组织和根的发育，侧生分支，顶端生长和次生生长等多个方面［21］。

本课题组通过转录组分析PsnCycD1；1过表达小黑杨植株，发现2 个与植物维管发育以及叶片、茎部等组织形成相关的基因PsnHB13以及PsnHB15为显著差异基因，其中PsnHB13为HDZip 蛋白家族Ⅰ类成员基因，PsnHB15基因为Ⅲ类成员基因。目前关于HD-Zip 蛋白参与周期蛋白调控植物发育的机制仍不深入，因此对于Psn-HB13与PsnHB15基因的研究将有助于进一步了解植物HD-Zip 转录因子功能和调控机制，可以更好地揭示木本植物中CYCDs的生物学功能，为CYCDs的调控机制研究提供有意义的参考和补充。

1 材料与方法

1.1 试验材料及试剂

供试材料为林木遗传育种全国重点实验室（东北林业大学）保存的小黑杨组培苗。Y2Hgold酵母感受态均购自上海唯地公司。BSC01S1 Biospin 质粒DNA 提取试剂盒购自博日公司；PCR 相关试剂、DNA Marker、限制性内切酶，DNA Ligation Kit，TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，PrimeScriptTMRT reagent Kit，SYBR Premix Ex

TaqTMⅡ均购自TaKaRa 公司（大连）；其他试剂为进口或国产分析纯。RNA-seq 测序由武汉博越致和公司完成。

1.2 试验方法

1.2.1PsnHB13与PsnHB15基因的生物信息学分析

利用在线软件InterPro（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/）对基因保守结构域进行分析；利用在线软件STRING（https：//cn.string-db.org/）对基因功能性蛋白质关联网络进行分析。

1.2.2PsnHB13与PsnHB15基因酵母表达载体构建及互作验证

参考Clontech Gold Yest Two-Hybrid System 说明书构建重组质粒，将重组质粒转化到Y2Hgold感受态细胞中，并涂布相应营养缺陷型培养基。

1.2.3PsnHB13过表达植株转录组分析

选取生长状态良好的3 月龄PsnHB13过表达量最高的株系L9 与野生型小黑杨的功能叶（从上至下第5 片叶片），L9 与野生型均取3 个生物学重复。经液氮速冻后，送武汉博越致和生物科技有限公司进行RNA-seq测序。

2 结果与分析

2.1 PsnHB13 与PsnHB15 基因在PsnCycD1；1转基因小黑杨中的表达差异

PsnHB13与PsnHB15为PsnCycD1；1过表达小黑杨转录组差异基因，首先采用实时荧光定量PCR 技术对转录组数据进行验证。以不同Psn-CycD1；1过表达小黑杨株系与野生型小黑杨组培苗叶片cDNA 为模板进行表达差异分析（见表1）。L1～L3 均为PsnCycD1；1高表达株系，L3 中Psn-CycD1；1表达量最高，为野生型植株350 倍，L2 中PsnCycD1；1表达相对较低，为野生型植株230 倍。根据qPCR 结果显示，PsnHB13与PsnHB15均随着PsnCycD1；1表达量升高而出现不同程度的升高且与野生型相比达到显著差异。L3 株系中PsnHB13基因表达量差异最大为野生型小黑杨的14 倍；PsnHB15基因表达量升高最多为野生型小黑杨的6 倍（见图1）。表明PsnCycD1；1直接影响Psn-HB13及PsnHB15的表达。

表1 本实验中所用引物Table 1 Primers used in this experiment

图1 PsnHB13与PsnHB15基因在不同株系的相对表达量WT.野生型；L1～L3.PsnCycD1；1 过表达植株；*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；下同Fig.1 Relative expression levels of PsnHB13 and PsnHB15 gene in different linesWT.Wild type；L1-L3.PsnCycD1；1 overexpression lines；*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；The same as below

2.2 PsnHB13和PsnHB15基因保守结构域分析

通过在线软件InterPro 输入PsnHB13 蛋白序列后，将蛋白质分类为家族并预测域和重要位点，分析蛋白质的功能，最终生成结构域分析（见图2A）。结果表明：PsnHB13主要包含HDZip class Ⅰplant 及HOMEOBOX-LEUCINE ZIPPER PROTEIN在内的2 个家族保守结构域；Homeobox dom、Hox 1、Homeodomain、Homeobox 2、Leu-Zip homoe 以及HALZ 6 个保守的域；Homeobox-like sf 和Homeodomain-like 2 个同源超家族；Homeobox CS、Homeobox 1、HTH motif 和HTHREPRESSR 4 个保守位点以及1 个未整合的HOMEOBOX-LEUCINE ZIPPER PROTEIN ATHB-13 结构域。通过GO tems 分析发现，PsnHB13在生物过程上富集在转录调控，DNA 模板化（GO：0006355）；分子功能上主要富集在DNA 结合转录因子活性，RNA 聚合酶Ⅱ特异性（GO：0000981）、DNA 结合（GO：0003677）、DNA 结合转录因子活性（GO：0003700）以及序列特异性DNA结合（GO：0043565）中。

图2 PsnHB13（A）和PsnHB15（B）的保守结构域及位置Fig.2 Conserved domains and positions of PsnHB13（A） and PsnHB15（B）

通过同样的方法对PsnHB15 氨基酸序列进行分析发现（见图2B）：PsnHB15主要包含HDZip Ⅲ及HOMEOBOX-LEUCINE ZIPPER PROTEIN ATHB-14 在内的2 个家族保守结构域。与PsnHB13 不同的是PsnHB15包含的保守结构域是HDZip Ⅲ而非HDZip Ⅰ，说明PsnHB13 与PsnHB15 属 于2 个不同的亚家族。PsnHB15 还包含Homeobox dom、Homeodomain、Homeobox 2、START lipid-bd dom 及MEKHLA 在内的5 个域；2 个先后存在于不同氨基酸位点的Homeobox-like sf同源超家族位点；bZIP、Bet v1-like、START_ArGLABRA2_like、CLASS ⅢHD-ZIP PROTEIN CNA1和HTHREPRESSR 在内的5 个保守位点，以及1 个与PsnHB13 相同的HOMEOBOX-LEUCINE ZIPPER PROTEIN ATHB-13未整合结构域。PsnHB15 未在生物过程上存在富集，但在分子功能上含有DNA结合（GO：0003677）、脂质结合（GO：0008289）、DNA 结合转录因子活性（GO：0003700）3 个GO 富集，其中DNA 结合和DNA 结合转录因子活性与PsnHB13 完全相同，脂质结合为PsnHB15 特有。PsnHB15 为Ⅲ类同源域-亮氨酸拉链（HD-Zip Ⅲ）蛋白质家族，其中包括来自拟南芥的5 个成员（REVOLUTA、ATHB-9/PHAVOLUTA、ATHB-14/PHABULOSA、ATHB-15/CORONA 和ATHB8），以及来自水稻（Oryza sativa）的 同 源 物（OsHOX9-10、OSHOX29、OsHOX32-33）［22-25］。这些蛋白质包含1个参与DNA 结合和蛋白质二聚化的HD-Zip 结构域、1 个START 结构域和1 个功能未知的保守C 端结构域。该家族调节顶端胚胎模式、胚胎芽分生组织形成、器官极性、血管发育和分生组织功能。它们显示出重叠、拮抗 和 发 散 功 能：PHABULOSA、PHAVOLUTA 与REVOLUTA 执 行 重 叠 功 能，PHABULOSA、PHAVOLUTA 和CORONA/ATHB15 基 因 执 行 与REVOLUTA 不同的重叠功能，而ATHB8 和CORONA 编码的功能在某些范围内与REVOLUTA 的功能均可拮抗组织并与其他组织中的REVOLUTA重叠［25］。

2.3 PsnHB13和PsnHB15蛋白质关联网络分析

在STRING 数据库输入PsnHB13 和PsnHB15氨基酸序列，然后在毛果杨（Populus trichocarpa）数据库中筛选互作蛋白，对有可能互作的蛋白进行预测，并生成蛋白质关联网络（见图3A）。预测结果显示，与PsnHB13 发生互作的蛋白共有10 条，这10 条蛋白分别是具有Tlc 结构域的蛋白质at5g14285，与PsnHB13 互作强度最高达到0.741；叶绿体类核DNA 结合家族蛋白；2 条锌指同源域蛋白2、2条锌指同源域蛋白11及4条未知蛋白。

预测结果显示与PsnHB15 互作的蛋白同样有10 条（见图3B）。这10 条与PsnHB15 互作的蛋白包括4 条与PsnHB15 同属于同源域亮氨酸拉链家族（HD-Zip）的蛋白，2 条转录阻遏物kan1 蛋白，1条衰老相关家族蛋白Mard1，1 条转录因子bHLH68 蛋白，1 转录因子MYB103 蛋白及1 条未知蛋白。根据预测的PsnHB15 互作蛋白分类显示，PsnHB15 极易与同家族HD-Zip 成员互作。这与预测的DNA结合转录因子活性相符合。

图3 PsnHB13（A）和PsnHB15（B）蛋白关联网络Fig.3 PsnHB13（A）and PsnHB15（B）protein association network

2.4 PsnHB15蛋白互作验证

以实验室前期构建的pROKⅡ-PsnHB13与pROKⅡ-PsnHB15过表达载体为模板［17］，构建pGBKT7-PsnHB13、pGBKT7-PsnHB15、pGADT7-Psn-HB13、pGADT7-PsnHB15酵母表达载体。

互作蛋白关联网络分析结果显示，PsnHB15更易与同家族基因互作，通过酵母双杂交实验，进一步验证预测结果。实验室前期已构建pGBKT7-Psn-CYCD1；1，pGADT7-PsnCYCD1；1载体［7］。参考Clontech Gold Yest Two-Hybrid System说明书，分别将对应质粒共转化至Y2Hgold酵母感受态细胞。通过判断SD/-Trp/-Leu/-His（TDO）、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/AbA（QDO/A）、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal/AbA（QDO/A/X）培养基平板中菌落生长状态，可以判定PsnHB15 与PsnHB13 存 在 相 互 作 用，PsnHB13 与PsnCycD1；1存在相互作用，PsnCycD1；1与PsnHB15很可能通过PsnHB13产生间接相互作用（见图4）。这与前期对基因互作蛋白的预测结果相符。

图4 酵母双杂交互作验证DDO.SD/-Trp/-Leu 培 养 基；QDO/A.SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/AbA 培养基；QDO/X/A.SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal/AbA 培养基；Positive control.pGBKT7-53、pGADT7-T 质粒共转；Negative control.pGBKT7-Lam、pGADT7-T质粒共转Fig.4 Yeast two-hybrid interaction for verificationDDO.SD/-Trp/-Leu medium；QDO/A.SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/AbA medium；QDO/X/A.SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal/AbA medium；Positive control.pGBKT7-53 and pGADT7-T plasmid co-transformation；Negative control.pGBKT7-Lam and pGADT7-T plasmid co-transformation

2.5 PsnHB13 与PsnHB15 小黑杨的遗传转化及分子检测

通过本实验室优化的小黑杨转基因体系［7］，经10～12 周获得小黑杨抗性生根苗。提取小黑杨抗性生根苗叶片DNA，通过PCR 检测阳性转基因植株（引物详见表1）。检测结果显示，共获得10 个PsnHB13过表达小黑杨株系（见图5A），3 个Psn-HB15过表达小黑杨株系（见图5B）。

图5 转基因株系DNA检测A.PsnHB13 过表达转基因小黑杨DNA PCR 检测电泳图（1.阳性对照；2～11.10 个转基因小黑杨株系；12.野生型植株对照；13.ddH2O阴性对照）；B.PsnHB15 过表达转基因小黑杨DNA PCR 检测电泳图（1.阳性对照；2～4.3 个转基因小黑杨株系；5.野生型植株对照；6.ddH2O阴性对照）；M.DL5000 MarkerFig.5 DNA detection of transgenic strainsA.PCR detection electrophoresis of PsnHB13 overexpression transgenic lines DNA（1.Positive control；2-11.10 transgenic lines；12.Wildtype plant control；13.ddH2O as negative control）；B.PCR detection electrophoresis of PsnHB15 overexpression transgenic lines DNA（1.positive control；2-4.3 transgenic poplar lines；5.Wild type plant control；6.ddH2O as negative control）；M.DL5000 Marker

通过实时荧光定量PCR 检测PsnHB13与Psn-HB15在转基因小黑杨植株中的表达情况（引物详见表1）。结果显示，10 个PsnHB13过表达株系均在mRNA 水平上超量表达，表达量最高为野生型5.0 倍，最低为野生型1.3 倍（见图6A）。3 个Psn-HB15过表达株系均在mRNA 水平上超量表达，表达量最高为野生型2.5 倍，最低为野生型1.5 倍（见图6B）。以PsnHB13L9、L7、L6 过表达株系为材料，检测PsnHB13与PsnHB15表达模式。结果显示：PsnHB15随PsnHB13表达量的升高而升高，PsnHB13表达量为野生型小黑杨5.0 倍时，Psn-HB15表达量升高至野生型小黑杨3.5 倍（见图6C）。与酵母双杂交结果一致，PsnHB13 与Psn-HB15 存在相互作用，并且过量PsnHB13促进Psn-HB15的表达。

图6 转基因株系表达量检测A.不同PsnHB13过表达株系中PsnHB13基因表达量（WT.野生型；L1～L10.不同转基因株系）；B.不同PsnHB15 过表达株系中Psn-HB15 基因表达量（WT.野生型；L1～L3.不同转基因株系）；C.不同PsnHB13过表达株系中PsnHB15基因表达量（WT.野生型；L6、L7、L9.不同转基因株系）Fig.6 Detection of the relative expression of transgenic linesA. PsnHB13 gene expression in different PsnHB13 overexpression line（sWT.Wild type；L1-L10.Different transgenic lines）；B.PsnHB15 gene expression in different PsnHB15 overexpression lines（WT.Wild type；L1-L3.Different transgenic lines）；C.PsnHB15 gene expression in differentPsnHB13 overexpression lines（WT.Wild type；L6，L7，L9.Different transgenic lines）

2.6 PsnHB13 与PsnHB15 过表达小黑杨叶片长宽比与质量统计

转基因小黑杨株系第4 叶片叶片长宽比差异在幼苗初期（顶芽生根培养后15 d）最明显，Psn-HB13过表达株系L9为野生型的1.83倍，叶型发生明显变化。但随着培养时间逐渐增加，60 d 后转基因与野生型叶片长宽比无明显差异（见图7A）。表明PsnHB13对小黑杨幼苗早期叶型发育产生影响。PsnHB15对小黑杨叶型发育影响与PsnHB13基本一致，均在幼苗初期（顶芽生根培养后15 d）第4 叶片叶片长宽比产生明显变化，L3 为野生型的2.16倍（见图7B）。说明PsnHB13与PsnHB15在小黑杨早期叶片形态发育中发挥作用。

图7 PsnHB13（A）和PsnHB15（B）过表达株系与野生型叶片长宽比Fig.7 Aspect ratio of PsnHB13（A）and PsnHB15（B）overexpression lines and wild type

测量并计算3 月龄野生型小黑杨与PsnHB13过表达株系从上至下第4～8 叶片干质量、鲜质量及其比值，结果显示：小黑杨野生型叶片平均鲜质量0.30 g，平均干质量0.09 g，干鲜质量比值为0.30。L7 株系叶片平均鲜质量为0.33 g，平均干质量为0.13 g，干鲜质量比值为0.39。L6株系叶片平均鲜质量为0.32 g，平均干质量为0.11 g，干鲜质量比值为0.34（见图8A）。L7 叶片的干鲜质量比值与野生型差别最大，相差0.09。

同样对3 月龄野生型小黑杨与PsnHB13过表达株系茎的干质量、鲜质量及其比值进行测量并计算。野生型小黑杨茎部平均鲜质量2.57 g，平均干质量0.90 g，干鲜质量比值为0.35。L9茎部平均鲜质量为1.86 g，平均干质量为0.93 g，干鲜质量比值为0.50；比值最低的L6 株系茎部平均干质量为0.73 g，平均鲜质量1.75 g，干鲜质量比值为0.45（见图8B）。

有趣的是，可以发现转基因株系显著提高了茎部及叶片干鲜质量比值，尤其是促进茎段物质积累。但通过对转基因株系以及野生型小黑杨株高测量发现，野生型小黑杨平均株高为45.7 cm，转基因小黑杨L9 平均株高最高，为37.5 cm，L6 平均株高最低，为26.1 cm（见图8C），L6 与野生型株高差异最大，比野生型矮19.6 cm，差异显著（P＜0.01）。PsnHB15过表达株系叶片、茎干鲜质量比与株高对比野生型无显著差异。

图8 PsnHB13过表达植株株高与质量比A.PsnHB13过表达植株与野生型小黑杨叶片干鲜质量比值；B.Psn-HB13 过表达植株与野生型小黑杨茎部干鲜质量比值；C.PsnHB13过表达植株与野生型小黑杨株高Fig.8 Plant height and mass ratio of PsnHB13 overexpression linesA.The dry and fresh weight ratio of PsnHB13 overexpression lines and wild-type leaves；B.PsnHB13 overexpression lines and wild-type stem dry and fresh weight ratio；C.PsnHB13 overexpression lines and wildtype height

2.7 PsnHB13过表达株系转录组分析

PsnHB13在转化小黑杨时，转基因小黑杨叶片干物质积累量发生明显变化。为进一步探究PsnHB13对小黑杨发育的影响，取3月龄生长状态良好且长势一致的PsnHB13过表达转基因株系L9与野生型叶片，送转录组测序。

2.7.1PsnHB13过表达株系叶片转录组测序质量及Unigene功能注释

PsnHB13过表达株系L9及野生型小黑杨叶片转录组测序后得到Raw reads 过滤之后的Input reads 值。WT 及转基因 株系L9 的Concordant pair alignment rate 均高于70%，符合分析要求。WT 组GC 含 量 为44.30%，质 量 参 数Q20和Q30分 别 为98.32%和94.27%，均大于90%，数据质量较好。PsnHB13过表达株系L9 组GC 含量为44.04%，质量参数Q20和Q30分别为98.83%和95.70%，均大于95%，质量良好。

2.7.2 差异基因筛选及GO 分类和KEGG pathways富集分析

GO 分为分子功能、生物过程和细胞组成3 个部分。WT 与PsnHB13过表达株系差异基因在分子功能上主要富集在：转录因子活性，序列特异性DNA 结合以及核酸结合转录因子活性等。在生物过程上主要富集在：化学反应（GO：0042221）；对有机物的反应（GO：0010033）；调节RNA 代谢过程（GO：0051252）；RNA 生物合成过程的调控（GO：2001141）；转录调控，DNA-模板化（GO：0006355）；对有机氮化合物的反应（GO：0010243）等（见图9A）。

在生物体内，不同的基因产物相互协调来行使生物学功能，对WT与PsnHB13过表达株系差异表达基因进行KEGG Pathway 注释分析有助于进一步解读基因的功能。差异表达基因主要富集在：转录因子，植物激素信号转导，细胞色素P450（Cytochrome P450），角质、木栓质和蜡的生物合成等通路中（见图9B）。

图9 富集分析A.PsnHB13过表达株系L9与野生型小黑杨差异基因GO富集分析；B.PsnHB13过表达株系L9与野生型小黑杨差异基因KEGG富集分析Fig.9 Enrichment analysisA.Analysis of GO enrichment of differential genes between PsnHB13 overexpression line L9 and wild-type Populus nigra；B.Enrichment analysis of differential gene KEGG between PsnHB13 overexpression line L9 and wild-type Populus nigra

通过KEGG 富集分析，共找到转录因子相关差异基因31 条，主要包括MADS-box转录因子、MYBP转录因子、ERF1转录因子、EREBP转录因子、ANT AP2-like转录因子、NFYA转录因子、RAV转录因子、PTI6转录因子、MYC2转录因子等。值得注意的是PsnHB13、PsnHB15所属HD-ZIP 家族其他转录因子也出现差异表达。植物激素是植物体内调节自身生理过程的重要有机化合物，对植物的生长发育起到关键性作用，根据差异基因KEGG 富集，进一步分析WT 与PsnHB13 过表达株系植物激素信号转导通路的变化。在此通路中共富集到23条基因，包括色氨酸代谢、玉米素生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、油菜素类固醇生物合成、α-亚麻酸代谢和苯丙氨酸代谢6 个途径中的SAUR蛋白家族基因、AHP含组氨酸磷酸转移蛋白基因、GH3 生长素响应基因、ERF1 乙烯响应转录因子、IAA 生长素响应基因BKI1 激酶抑制剂、JAZ茉莉酸ZIM 结构域蛋白、NPR1调节蛋白、MYC2转录因子、EBF1_2 结合蛋白、PR1 蛋白，而这些差异基因又主要富集在色氨酸代谢途径（见图10），其中红色方框为显著上调的基因，绿色方框为显著下调的基因。生长素信号转导因子AUX1、3 类生长素旱期响应基因Aux/IAA、GH3、SAUR均上调表达，最终促进植物细胞增大生长。

图10 植物激素信号转导色氨酸代谢途径基因差异表达Fig.10 Differential expression map of plant hormone signal transduction tryptophan metabolic pathway genes

3 讨论

CYCD1；1是探究植物的生长规律、揭示细胞周期与生长调节之间的关键基因，在小黑杨中过表达PsnCYCD1；1出现偏心生长、纤维细胞形体改变、细胞壁变厚等微观结构变化，导致杨树中其他D 类周期蛋白、周期蛋白激酶、周期蛋白激酶抑制因子、下游分裂基因及纤维素发育、木质素发育相关基因的转录水平变化［7］。为进一步了解植物HD-Zip 转录因子功能和调控机制，更好地揭示木本植物中CYCDs的生物学功能，对小黑杨Psn-CYCD1；1下游基因——基因PsnHB13与PsnHB15功能进行探究。PsnHB13含有HDZip class Ⅰ结构域，PsnHB15 含有HDZip class Ⅲ结构域，2 个基因属于HDZip 不同亚家族，但均含有HOMEOBOXLEUCINE ZIPPER PROTEIN 结构域，酵母双杂交互作验证结果表明PsnHB15 与PsnHB13 存在相互作用。

有研究表明ZeHB13转录物优先在植物的原形成层细胞中积累，可能在原形成层和木质部前体细胞中表达和发挥作用［26］。PsnHB13过表达小黑杨植株叶片早期发育出现显著差异，长宽比显著增加，同时叶片与茎部干鲜质量比值较野生型显著提高，推测正是由于PsnHB13同样影响植物原形成层的发育，促进转基因小黑杨干物质积累。类似地，AtHB15启动子表达仅限于叶和根中的原形成层细胞［27］，PsnHB15过表达小黑杨植株叶片早期发育同样出现长宽比增加的趋势，这些结果强烈暗示PsnHB13/15参与形成层功能。

BRs 合成缺陷突变体主茎横切面中形成层异常，产生过量的韧皮部细胞以及减少的木质部细胞，BR 合成抑制了木质部的发育。ZeHB13的表达受油菜素甾体激素影响，油菜素类固醇对Ze-HB13的表达具有反馈促进［26-28］。BKI1 是感知BR信号的富含丝/苏氨酸的类受体蛋白激酶BRI1 的负调控蛋白，PsnHB13转录组数据分析显示，PsnBKI1为显著差异基因，说明PsnHB13的过量表达同样对油菜素类固醇的合成产生影响。而只有Psn-HB13在原形成层和木质部前体细胞中表达和发挥作用，才可能影响菜素类固醇感知机制。但仍需要进一步分析以阐明油菜素类固醇与PsnHB13表达之间的关系。油菜素内酯促进ZeHB13的表达，形成反馈调节。除油菜素内酯外，生长素也是诱导ZeHB13、AtHB15、AtHB8等基因表达所必需的，原形成层细胞向TEs 分化需要同时存在生长素和油菜素内酯。PsnHB13转录组数据显示，在PsnHB13过表达的小黑杨中，AUX1，Aux/IAA等生长素合成基因与野生型相比出现差异表达。但PsnHB13如何同时影响生长素和油菜素内酯的合成还有待进一步探究。

多种HD-Zip Ⅲ转录本以1种独特的组合在不同的木质部细胞类型中积累，HD-Zip Ⅲ蛋白可以形成异质二聚体和同源二聚体［29-30］。PsnHB13、PsnHB15蛋白质网络关联分析与酵母双杂交结果也进一步证明PsnHB15对HD-Zip 蛋白具有较高的互作概率。因此，HD-Zip Ⅲ蛋白的异质二聚体和同源二聚体的特定组合可能在某些木质部细胞类型方面发挥作用，进而对木材发育产生影响。