母体血清微RNA-146a-5p联合三联法检测在孕中期唐氏综合征筛查中的意义

肖欢，张志安，梅军华，张仙

作者单位：1黄冈市中心医院妇产科，湖北 黄冈 438000；2湖北省妇幼保健院妇产科，湖北 武汉430000

唐氏综合征是染色体异常造成的先天性疾病，又称为21-三体综合征。终止妊娠是最有效的方法［1-2］。羊水穿刺是唐氏综合征产前筛查的主要手段，但可引发1.0%胎儿流产，且仅限于唐氏综合征高危孕妇筛查。目前国内孕中期唐氏综合征胎儿筛查方法多为甲胎蛋白（AFP）+人绒毛膜促性腺激素（β-hCG）+游离雌三醇（uE3）三联法［3］。有学者发现三联法检测（AFP+β-hCG+uE3）仍然存在一定程度的假阳性率［4］从而只能作为筛查方法。近年来，研究发现唐氏综合征病儿胎盘合体滋养层细胞可脱落RNA产物至母体血液中，因此母体血液中miRNA 可能存在唐氏综合征疾病标志物［5］。微RNA-146a-5p（miR-146a-5p）是参与天然免疫的调控因子，具有调控滋养层细胞的增殖能力。有研究显示巨噬细胞分泌的miR-146a-5p 高表达时，抑制滋养细胞侵袭和迁移［6］。因此，本研究将探讨母体血液miR-146a-5p 表达水平联合三联法对孕中期唐氏综合征的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2017 年1 月至2020 年8 月于黄冈市中心医院孕中期行唐氏综合征筛查结果为阳性的孕妇65 例（病例组），孕周范围15～20 周，年龄范围24～38岁，年龄（32.18±4.32）岁。同期选择本院健康的妊娠孕妇65 例（对照组），孕周范围15～20周，年龄范围24～38，年龄（31.91±4.41）岁。纳入标准：（1）唐氏综合征产前筛查为高风险，并在终止妊娠后经病理检测证实为唐氏综合征胎儿；（2）单胎妊娠；（3）既往无不良妊娠史。排除标准：（1）合并妊娠期糖尿病、妊娠期高血压、妊娠期甲状腺功能异常者；（2）合并妊娠期肝病、肾病并发症；（3）存在唐氏综合征家族史；（4）存在无脑儿、肾变性、脑积水等胎儿畸形。本研究对象或其近亲属签署知情同意书，且经黄冈市中心医院伦理委员会审核批准（批号20161109）。

1.2 唐氏综合征临床筛查方法在孕妇空腹状态下采集静脉血3～4 mL，使用美国贝克曼库尔特Access 2 化学发光免疫分析仪检测AFP，β-hCG 以及uE3 等指标，依据血清uE3、β-hCG、AFP 水平换算为中位数的倍数（multiple of the median，MOM），唐氏综合征高风险评估界限，即β-hCG MOM＞2.5；AFP MOM值＞2.5；uE3MOM值≤2.0［7］。

1.3 实时荧光定量PCR 法检测孕妇血清中miR-146a-5p 的水平病例组、对照组孕妇入院行唐氏筛查时采取静脉血3～4 mL，离心，留上清液装于采血管中，提取总RNA，依据Rever Tra Ace Qpcr RT Kit（日本Takara公司）指导书反转录得到互补DNA。采用7500 实时荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司）对miR-146a-5p及内参U6进行扩增反应。用2-ΔΔCt法计算miR-146a-5p 相对表达量。miR-146a-5p、U6 引物由上海生工合成。

1.4 统计学方法采用软件SPSS 21.0 对数据进行分析，计量资料以表示，两组间比较采用独立样本t检验；计数资料用例（%）表示，采用χ2检验。采用受试者操作特征（ROC）曲线分析母体血清miR-146a-5p 联合三联法对孕中期唐氏综合征的预测价值。采用Pearson法分析miR-146a-5p相对表达水平与血清AFP、uE3、β-hCG MOM 值的相关性，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较病例组、对照组年龄、孕周等项均差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 两组孕妇一般资料比较

2.2 两组血清miR-146a-5p 相对表达水平及血清AFP、uE3、β-hCG MOM 值与对照组相比，病例组血清AFP、β-hCG MOM 值及血清miR-146a-5p 相对表达水平较高（P＜0.05），uE3MOM 值较低（P＜0.05），见表2。

表2 两组孕妇血清miR-146a-5p水平及血清AFP、uE3、β-hCG MOM值比较∕

表2 两组孕妇血清miR-146a-5p水平及血清AFP、uE3、β-hCG MOM值比较∕

注：miR-146a-5p为微RNA-146a-5p，AFP为血清甲胎蛋白，MOM为中位数倍数，uE3为游离雌三醇，β-hCG为人绒毛膜促性腺激素。

2.3 血清miR-146a-5p 相对表达水平与血清AFP、uE3、β-hCG MOM 值相关性分析Pearson 法分析显示，miR-146a-5p 与AFP、β-hCG 呈正相关（r=0.41，r=0.46，均P＜0.001），与uE3呈负相关（r=-0.57，P＜0.001），见图1。

图1 孕中期唐氏综合征的孕妇微RNA-146a-5p（miR-146a-5p）与甲胎蛋白（AFP）、人绒毛膜促性腺激素（β-hCG）、游离雌三醇（uE3）相关性分析：A为AFP相关性分析；B为β-hCG相关性分析；C为uE3相关性分析

2.4 miR-146a-5p联合三联法对孕中期唐氏综合征的预测价值分析以因变量对照组定义为0，孕中期唐氏综合征定义为1，自变量分别为miR-146a-5p、AFP+uE3+β-hCG（三联）及miR-146a-5p 联合三联的预测概率（经miR-146a-5p、AFP、uE3、β-hCG 二元logistic 回归得到），进行ROC 曲线分析，结果显示，AFP、uE3、β-hCG 预测孕中期唐氏综合征的曲线下面积（AUC）及其95%CI分别为0.74（0.66，0.83）、0.78（0.70，0.86）、0.76（0.67，0.84）；AFP+uE3+β-hCG预测孕中期唐氏综合征的AUC 及其95%CI为0.85（0.78，0.92）；miR-146a-5p预测孕中期唐氏综合征的AUC 及其95%CI为0.86（0.79，0.93）；miR-146a-5p+AFP+uE3+β-hCG 预测孕中期唐氏综合征的AUC 及其95%CI为0.91（0.86，0.96），灵敏度为86.20%，特异度为80.00%。其中miR-146a-5p+AFP+uE3+β-hCG 预测AUC 值高于AFP+uE3+β-hCG 预测AUC值（Z=1.79，P＜0.05），见表3。

表3 miR-146a-5p联合三联法对孕中期唐氏综合征的预测价值分析

3 讨论

随着优生优育政策的全面普及，孕产妇产前筛查意识逐渐增强。AFP、uE3、β-hCG 三联是目前临床上应用较为广泛的血清联合筛查物，具有较高的安全性［8］。AFP 由胎儿肝脏和卵黄囊分泌的糖蛋白，通过胎儿的泌尿系统被排泄到羊水中，羊水中AFP 可被转运到母体血液中［9］。正常妊娠女性血液中AFP 浓度随孕周增加而逐步升高。若胎儿肝脏发育不全，母体血液中AFP浓度会相应下降［10］。uE3是由胎儿及胎盘分泌，其表达水平随孕周增加逐渐上升，大约在孕90 d 时达到峰值［11］。uE3 可在胎儿宫内发育过程中具有较好的调节作用［12］。hCG主要由胎盘、滋养层细胞分泌的孕期激素。hCG 可吸附在滋养层细胞表面而阻止母体淋巴细胞攻击胚胎滋养层细胞［13］。在孕周范围14～20 周时，hCG 浓度将随着孕周增加而逐渐下降，但唐氏综合征病儿由于胎盘发育速度较慢，导致hCG 下降速度较为缓慢，由此发现唐氏综合征孕妇血清中hCG 水平较同孕周的正常孕妇高［14］。本研究发现病例组血清AFP、β-hCG MOM 值水平较对照组高，uE3MOM 值较对照组低（P＜0.05），AFP+uE3+β-hCG 预测孕中期唐氏综合征的AUC 为0.85，灵敏度为83.10%，特异度为75.40%，提示三联法对预测孕中期唐氏综合征具有预测价值。

妊娠期胎盘可表达独特的miRNA，其中滋养层miRNA 可被微粒体携带进而被大量释放到母体血液中，参与细胞增殖和分化，由此猜测miRNA 可能与妊娠期疾病发生相关［15-16］。母胎细胞间通信依赖于滋养层的侵袭和迁移。许多研究已经阐明了miRNA 在滋养层细胞进展中的重要作用。miR-146a 是位于人染色体5q34 上，可通过靶向多个基因从而在机体中发挥作用。miR-146a-5p 参与细胞的增殖、侵袭和迁移。陈芳荣等［17］研究显示，子痫前期胎盘组织中miR-146a-3p 高表达，miR-146a-3p是通过影响滋养层细胞而参与子痫前期疾病发生。miR-146a-5p对乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力有抑制作用［18］。Peng 等［19］研究显示，子痫前期胎盘组织中miR-146a-5p 呈高表达，且miR-146a-5p 过表达会抑制滋养层细胞增殖和侵袭，从而介导子痫前期疾病发生。本研究发现病例组血清miR-146a-5p表达水平较对照组高，提示miR-146a-5p 可能影响唐氏综合征发生。猜测miR-146a-5p 可能通过影响胚胎滋养层细胞增殖而影响hCG 表达水平变化最终影响唐氏综合征疾病发生。本研究发现miR-146a-5p 预测孕中期唐氏综合征的AUC 为0.86，灵敏度为81.50%，特异度为87.70%，miR-146a-5p 与AFP、β-hCG 呈正相关，与uE3呈负相关，ROC 分析显示，miR-146a-5p+AFP+uE3+β-hCG 预测子孕中期唐氏综合征的AUC为0.91，诊断价值高于三联法。

综上所述，母体血清中miR-146a-5p 对唐氏综合征的诊断效能优于AFP、uE3、β-hCG 单独诊断效能，miR-146a-5p联合三联法对孕中期唐氏综合征的诊断效能具有较高的临床价值。但本研究样本来源单一，样本数量有限，后续仍需扩大样本中心，对本研究进行深入探讨。