鱼胶原蛋白肽经Strat-MTM 膜透皮吸收试验研究

刘利格，李志国，宋 萃，许智敏，刘爱青，高建萍，王海燕

（1. 北京盛美诺生物技术有限公司，北京 100062；2.中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京 100190；3. 中国科学院大学 化学工程学院，北京 100049）

0 引言

鱼胶原蛋白肽是以鱼皮、鱼鳞、鱼骨等为原料经蛋白酶水解后的产物，具有多种生理调节功能，如美容护肤、补钙健骨[1]、止血免疫[2]、保肝护肝[3]、保护和修复胃黏膜[4-5]等。胶原蛋白肽除了具有报道的生物活性，还因其天然、安全、易配伍等特点，在食品、医药和化妆品领域广泛发挥作用。关于胶原蛋白肽凝胶、胶原蛋白肽绷带止血，促进伤口愈合[6-7]，胶原蛋白肽喷雾、胶原蛋白肽面膜（面霜）、眼霜改善皮肤状态[8-9]等胶原蛋白肽外用制剂有效性的报道很多，但是外用胶原蛋白肽皮肤渗透性及作用机理等研究报道较少。

在医药和化妆品领域，体外透皮试验经常用来进行外用制剂活性物质的筛选和渗透研究[10]。长期以来，离体动物皮肤被广泛用于皮肤外用制剂的体外透皮研究，关于胶原蛋白肽的离体动物皮肤透皮吸收也有一些研究。影响胶原肽透皮的因素很多，透皮介质、胶原蛋白肽分子量大小、来源不同带来的组成差异、促透剂的使用等。不同动物皮肤存在种属、个体、部位、年龄、性别等差异，使得试验的重复性和重现性不佳[11]。为解决上述问题，参考医药和化妆品人工膜透皮的研究，选择Strat-MTM作为替代膜研究了其对鱼胶原蛋白肽的透皮能力，为后续更深入的研究提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽（M.W.500，M.W.1000）、罗非鱼鱼鳞胶原蛋白肽（M.W.500，M.W.1000） （以下简称YP500，YP1000，YL500，YL1000），北京盛美诺生物技术有限公司提供；Strat-MTM皮肤专用膜，美国默克密理博公司提供；羟脯胺酸（Hyp） 标准品、2,4 -二硝基苯肼，Sigma-Aldrich 公司提供；乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

TP-6 型透皮扩散仪，天津天河分析仪器有限公司产品；Agilent 1100 型高效液相色谱仪，自动进样器，DAD 检测器，美国Agilent 公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 羟脯胺酸含量测定

（1） 透皮接收液预处理。取接收液0.5 mL，加入等体积的浓盐酸，真空封管，于110 ℃条件下水解20 h。水解液用浓度为6 mol/L 的氢氧化钠溶液中和后，定容至2 mL。分别取空白、样品、 Hyp 系列标准液100 μL，加入浓度为0.5mol/L 碳酸氢钠溶液200 μL，1%2,4-二硝基氟苯乙腈溶液100 μL，60 ℃下衍生1 h。冷却后加入0.1mol/L 磷酸二氢钾溶液600 μL。离心后上机进样。

（2） Hyp 标准溶液。Hyp 系列标准溶液质量浓度为5，10，20，50，100，200，400 μg/mL。

（3） 色谱条件。Agilent Zobax sb C18型色谱柱（5 μm，4.6×250 mm）；流动相：A 相为0.05 mol/L乙酸钠，B 相为乙腈-水（1∶1），流速0.5 mL/min。梯度洗脱，程序为0~15 min：A 相由70%降至45%；15~25 min：A 相由45%升至100%；25~35 min：A相由100%降至70%；35~45 min：A 相70%；柱温30 ℃，进样量10 μL，检测波长360 nm。

1.2.2 透皮试验方法

人工膜直接固定在样品池和接受池之间。

样品池中为10%的胶原蛋白肽生理盐水溶液，以生理盐水作为空白对照。接受池中加满生理盐水，容量为17 mL，保持恒速搅拌和恒温，水浴温度37±0.5 ℃，转速300 r/min。于2，4，6，8，24 h 分别取样1 mL，同时补加等量的生理盐水。测定取出液中Hyp 的质量浓度，按以下公式计算单位面积的累计透过量（Qn） 和透皮速率常数（J）：

式中：Cn——第n个取样点测得的Hyp 质量浓度，μg/mL；

Ci——第i个取样点测得的Hyp 质量浓度，μg/mL；

10——Hyp 与胶原蛋白肽的折算系数；

V——接受池容量，为17 mL；

V0——每个时间点分取体积，为1 mL；

A——渗透面积，为1.54 cm2。

以累积透过量Qn对时间t进行线性回归，所得方程的斜率即为透皮速率常数J，单位为μg/cm2/h。

2 结果与分析

2.1 时间对鱼胶原蛋白肽经Strat-MTM 渗透的影响

鱼胶原蛋白肽经Strat-MTM透皮的单位面积累计透过量随时间的变化趋势见图1。

图1 鱼胶原蛋白肽经Strat-MTM 透皮的单位面积累计透过量随时间的变化趋势

由图1 可知，4 种鱼胶原蛋白肽单位面积的累计透过量均随着透皮时间延长不断增加，且透皮速度（J） 存在差别，与文献中大鼠、小鼠皮肤对胶原蛋白的透皮吸收趋势一致[12-15]。

2.2 平均分子量对鱼胶原蛋白肽经Strat-MTM 膜渗透的影响

YL500，YP500，YL1000 和YP1000 这4 种胶原蛋白肽的质量分数为10%，进行在24 h 内的Strat-MTM膜单位面积累计透过量（Q24）。

不同平均分子量鱼胶原蛋白肽的24 h 内单位面积累计透过量见图2。

图2 不同平均分子量鱼胶原蛋白肽的24 h 内单位面积累计透过量

由图2 可知，低平均分子量胶原蛋白肽的Q24大于高平均分子量鱼胶原蛋白肽，这与文献中报道的胶原蛋白肽经离体小鼠皮肤的透皮趋势一致，由于小鼠皮肤角质层的屏障作用，分子量越小的物质越易透过皮肤角质层，而分子量大的则较难被吸收[12-15]。同样，Strat-MTM能够区分不同分子量大小的胶原蛋白肽的透皮速率，可能与它具有多孔径和扩散性不同的多层结构有关[16]。

另外，相同平均分子量的鱼鳞、鱼皮胶原蛋白肽的Q24也存在差异。刘楚怡等人[17]也报道了海蜇、牛骨和鳕鱼皮胶原蛋白肽透皮速率随时间变化存在差异。这一趋势一方面可能与胶原蛋白肽的分子量大小分布有关，另一方面也可能与鱼胶原蛋白多肽的辛醇-水分配系数有关：辛醇-水分配系数不同，各胶原蛋白肽与皮肤双脂质层极性头部的结合程度和穿膜速率不同；Strat-MTM浸渍了模拟皮肤脂质组成的C6-C26的合成脂质，对亲水性和疏水性物质均有良好的透皮性质，通常亲水性物质透膜速率大于亲脂性物质[16]。

2.3 质量分数对胶原蛋白肽经Strat-MTM 膜渗透的影响

根据文献报道，胶原蛋白肽溶液质量分数对经离体动物皮肤的透皮累计透过量有影响。为研究不同质量分数胶原蛋白肽对经Strat-MTM人工膜单位面积累计透过量的影响，分别配制质量分数（C） 为1%，5%和10%的YP500 和YL1000 的胶原蛋白肽溶液进行透皮试验。随着质量分数的增加，单位面积累计透过量增加，但最终透过量逐渐减小，与胶原蛋白肽质量分数对小鼠皮肤的透皮吸收影响类似[17]。这可能是由于质量分数不同带来的供给液黏性变化造成的，溶液黏性增加使得透皮过程变得缓慢，其影响大于供给池和接受池质量分数差的影响。

不同质量分数胶原蛋白肽的24 h 内单位面积累计透过量见表1。

表1 不同质量分数胶原蛋白肽的24 h 内单位面积累计透过量

2.4 Strat-MTM 对胶原蛋白肽的透皮动力学分析

不同胶原蛋白肽经Strat-MTM的渗透动力学参数见表2。

表2 不同胶原蛋白肽经Strat-MTM 的渗透动力学参数

由表2 可知，各胶原蛋白肽经Strat-MTM膜透皮的单位面积累计透过量随时间的延长呈线性增加，复合零级动力学方程。透皮吸收系数（J）即透皮速率常数，J（YP500）＞J（YL500）＞J（YP1000）＞J（YL1000）。

皮肤由多层结构组成，含有脂质组分最外层的角质层是阻止胶原蛋白肽透过的最大屏障。Clément P 等人[18]在研究中评价了含疏水材料和浸渍有模拟皮肤脂质物质的人工膜模拟动物皮肤透皮性能的重要性。Uchida T 等人[19]通过扫描电镜和透射电镜对Strat-MTM的结构进行观察，确认其具有3 层结构，密度由上至下依次减小，脂质存在于上面2 层，使得Strat-MTM具有渗透梯度，可以更好地模拟动物皮肤。

3 结论

在透皮试验中，人工合成膜用来模拟人体皮肤。作为离体人体和动物皮肤替代品，人工膜操作简单，结果重现性好，较生物膜易于获取和储存、试验重复性好[20]，不涉及伦理问题。常用的透皮渗透人工膜有聚硅氧烷基膜，如SilatosTM、Silastic和聚二甲基硅氧烷[21]、纤维素膜[22-23]等，但药物经Strat-MTM膜与经离体动物皮肤的渗透相关性比这些膜更好。与人体皮肤相似，Strat-MTM膜具有多个不同扩散性的分层。它的外侧是两层聚醚砜更耐扩散，底部是更开放和扩散的聚烯烃层。这些密度不同的聚合物形成多孔结构，不同的孔径和扩散性使Strat-MTM具有渗透梯度，且在多孔结构浸渍了合成脂质混合物，更类似人体皮肤结构[19]。

试验中，平均分子量500，1 000 Da 的罗非鱼鳞、鱼皮胶原蛋白肽经Strat-MTM膜渗透随透皮时间的延长，单位面积累计透过量增加，复合零级动力学方程。不同平均分子量的胶原蛋白肽经Strat-MTM透皮速率存在差异。Strat-MTM可作为离体动物皮肤的替代膜进行透皮试验研究。