同源四倍体甜荞诱导方法研究

赵建栋, 李秀莲, 陈稳良, 史兴海, 刘晓东, 秦秀珍

(1.山西农业大学农业基因资源研究中心, 太原 030031;2.山西农业大学农学院, 太原 030031)

甜荞(FagopyrumesculentumMoench)生育期短、适应性广、耐旱、耐瘠,可种植于多种逆境胁迫环境。甜荞食药同源,籽粒蛋白质含量高,而且人体必需的氨基酸种类齐全、数量多、比例合适;籽粒富含芦丁,芦丁具有扩张血管、抗栓塞、降血脂、胆固醇,防治心脑血管疾病的作用[1],是功能食品原料源。因此,甜荞是无可替代的特色杂粮作物。据不完全统计,全国育成的甜荞品种约35个,主要是二倍体品种(33个)[2]。而多倍体水稻[3]、谷子[4]、高粱[5]、哈密瓜[6]等育种研究表明,由于染色体加倍后产生的剂量效应,具有提高产量、品质的潜力,多倍体甜荞育种越来越受到育种者重视。

据报道,国外主要是用秋水仙素溶液处理荞麦干种子选育四倍体荞麦品种,如美国在20世纪30年代育成了四倍体荞麦品种Penquad[7];国内李德利等[8]用秋水仙素溶液处理甜荞发芽种子,创制四倍体甜荞种质;赵钢等[9-10]、杨敬东等[11]、 廉立坤[12]用秋水仙素溶液处理苦荞幼苗获得了四倍体苦荞品系和种质;前人用秋水仙素溶液处理甜荞幼苗获得了四倍体甜荞品种和品系[13-19]。不同甜荞诱导方法的研究中,其诱导效果参差不齐。因此,本试验同时用不同浓度秋水仙素溶液处理二倍体甜荞亲本干种子、发芽种子和幼苗,创制四倍体甜荞新品系,旨在研究诱导同源四倍体甜荞最佳方法,供荞麦育种者参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试甜荞品种为品甜荞1号(山西农业大学农业基因资源研究中心)和西农9976(西北农林科技大学农学院);试验器材有显微镜、烧杯、量筒、滴管、棕色瓶、小烧杯、吸管、脱脂棉、镊子等。诱变试剂采用秋水仙素粉剂(由上海试剂化工厂进口分装),用蒸馏水配成0.1%、0.2%和0.3%三种浓度的液体分别贮于3个棕色瓶内,备用。

1.2 方 法

1.2.1多倍体诱导处理

用三种浓度0.1%(B1)、0.2%(B2)和0.3%(B3)的液体分别对甜荞品种品甜荞1号和西农9976干种子(大而饱满)(A1)、发芽种子(胚根长度≤0.5 cm)(A2)和幼苗(两片子叶刚展开)(A3)进行处理: 1) 把干种子分别放入三种浓度的秋水仙素溶液中,在夏季常温下浸24 h,然后分别播种于10个大号花盆内,每盆播5粒种子;设对照(ck 1),干种子用蒸馏水(浓度0)(D)浸种24 h,然后在4个花盆中每盆播种5粒种子。 2) 把发芽种子在夏季常温下分别浸入三种浓度的秋水仙素溶液中16 h,然后按处理药液的不同浓度分别播种在10个大号花盆内,每盆播5粒发芽种子;设对照(ck 2),将20粒发芽种子浸入蒸馏水中16 h后播于4个花盆中。 3) 在30个长幼苗的大号花盆中,每盆均匀地留5株,拔除其余幼苗。当幼苗子叶完全展开时,把分别浸透三种浓度药液的脱脂小棉球夹在叶柄中间的生长点,每种浓度各处理10盆,每天早晚各处理1次,每次滴几滴药液浸透棉球,连续2～3 d,处理时气温夏季常温;设对照3(ck 3),用蒸馏水处理4个花盆中的20株幼苗生长点,每天早晚各处理1次,每次滴几滴药液浸透棉球,连续2～3 d,处理时气温夏季常温如表1。设对照(ck 1),蒸馏水(药物浓度0)浸种24 h,然后在4个花盆中每盆播种5粒种子。

表1 各处理及对照设置Table 1 Treatments and control setting

处理与对照均计算植株加倍率和诱导率。

加倍率/%=[加倍成功株数(收到1粒及1粒以上加倍种子的植株)/成活株数]×100%;

1.2.2多倍体甜荞形态特征鉴定

每个处理当代(C 1)多倍体和二倍体(对照)在幼苗期、花期和成熟期分别对胚轴、子叶、真叶、花和籽粒的形状、大小、颜色等进行观察、比较、记载、拍照和挂牌。

1.2.3多倍体甜荞农艺性状鉴定

为了检验C 1多倍体遗传特性,避免变异分枝在膨大节处折断以及获得更多多倍体籽粒,所以在第二代(C 2)和第三代(C 3)继续观察每个处理多倍体真叶大小、叶色深浅、薄厚、花的花瓣形状、大小、颜色深浅,在盛花期测量叶面积(叶片最长度×叶片最宽度)并记载单株叶片数;成熟期测量多倍体株高、茎粗(植株底部第一节间中部周长)、主茎分枝、单株粒重、千粒重、结实率、生育期,并与对照二倍体比较。

1.2.4多倍体细胞学鉴定

在实验室用显微镜测定多倍体花粉粒、叶片保卫细胞、气孔密度的大小,用常规根尖压片观察染色体数目,与二倍体亲本进行比较。

2 结果与分析

2.1 秋水仙素诱导效应

2.1.1不同处理时期的诱导效应

目前，虽然图书馆在信息服务方面取得了长足进展，服务功能越来越全面，数字资源建设初见成效，但是各高校图书馆在公众号建设内容和建设思路方面高度一致，缺少有特色的信息服务和针对各自师生定制化的信息推送服务，在后续的建设过程中，图书馆在完善数字资源的同时，需要深入研究用户行为数据挖掘技术，对用户数据进行分析、归类，根据用户需求作出分类向导及决策，提供定制化推荐、检索、推送等服务。具体举措如下[4-5]。

以A1、A2、A3分别代表种子、发芽种子和苗期处理,不同处理时期染色体加倍效应如表2。

由表2可以看出,A2处理加倍率(52.7%)最高,但处理后死亡株数(76株)也最高,故不能获得最好的处理效果。A1处理虽然死亡株数(16株)低,但加倍率(19.4%)也最低,因此处理效果也不理想。A3处理加倍率(45.5%)较高,虽然略低于A2处理的加倍率,但成活株数(110株)远比A2处理(74株)多,故A3处理效果(33.3%)最佳。

表2 处理时期(A)的不同效应Table 2 Different effects of treatment period (A)

2.1.2不同浓度的诱导效应

用B1、B2、B3分别代表处理药液秋水仙素的浓度0.1%、0.2%和0.3%,不同浓度处理染色体加倍效应如表3。

表3 药物浓度(B)不同水平的效应Table 3 Drug concentration (B) effects at different levels

由表3可知,B1处理时,虽然死亡数最少(43株),但加倍率(35.34%)最低,处理效果最差;B3处理时,加倍率(60.0%)最高,但植株的死亡株数(80株)也最高,故不能获得最好的处理效果。B2处理时,加倍率(46.67%)较高,虽然低于B3处理的加倍率,但成活株数(105株)远比B3处理(70株)多,故0.2%浓度药液处理效果(32.66%)最佳。

2.1.3处理时期和药液浓度二因素诱导效应

处理总数相同的情况下,不同处理时期和不同药液浓度处理后的加倍成功株数、成活株数和加倍率如表4。

表4表明,植株成活率从处理时期看A1>A3>A2,从药物浓度看B1>B2>B3,可见植株成活率以组合A1B1为最高,组合A2B3最低。在处理总数一致的情况下, 更重要的是看诱变成功的株数,由A1→A2→A3和B1→B3→B2诱变成功株数递增,以A3B2为最高,A1B1为最低。综上,处理时期和药物浓度的最佳组合是A3B2,其次是A3B3,第三是A3B1。植株成活株数以A1B1(47株)为最高,但加倍率(14.9%)最低;A3B3加倍率(82.6%)最高,但加倍成功株数(19株)和成活株数(23株)均不是最高;A3B2诱变成功株数(23株)最高,成活株数(35株)和加倍率(65.7%)均相对较高。可见加倍率最高的加倍成功株数不一定最高,不能一味追求加倍率,更重要的是同时考虑加倍成功株数和成活株数。综上,处理时期和药物浓度的最佳组合是A3B2。说明0.2%浓度的药液处理幼苗生长点效果最佳。

ck 1处理20粒种子存活18株,加倍成功0株。

ck 2处理20粒发芽种子存活17株,加倍成功0株。

ck 3处理20株幼苗存活18株,加倍成功0株。

ck 1、ck 2和ck 3之间无明显差异,说明秋水仙素是甜荞染色体加倍的有效药物。

2.2 多倍体形态特征

2.2.1处理当代(C 1)形态特征

秋水仙素水溶液处理甜荞当代在整个生育过程变异均较为明显,首先是幼苗期变异植株主茎生长点伸长受抑制、进而膨大,胚轴加粗、颜色加深(深紫色)、子叶变厚、颜色加深(深绿),从膨大节长出的真叶皱缩、叶缘不整齐、叶色变深,有的在膨大节停止生长、子叶变紫、最后干枯死亡;变异植株生长到现蕾期,真叶变厚、颜色变深、叶脉颜色变深、叶片变大、但植株由于药剂作用影响生长、故株高变矮;变异植株花期花瓣前端变钝、花瓣变长、变宽、花变大、颜色变深;最后成熟期籽粒变长、变宽、变大(图1)。

注:A为主茎生长点膨大;B为幼茎增粗、颜色变深;子叶变厚、颜色变深;真叶皱缩叶缘不齐; C为子叶颜色变紫;D为幼苗期对照植株;E为真叶变厚、颜色变深、叶脉颜色变深、叶片变大;F为现蕾期对照植株; G为花瓣先端变钝、花瓣变长、变宽、花变大、颜色变深;H为对照花;I为籽粒变长、变宽、变大;J为对照籽粒。图1 秋水仙素诱导甜荞形态变异情况Fig.1 Morphological variation of common buckwheat induced by colchicine

2.2.2处理第二代(C 2～C 4)形态特征及农艺性状

处理C 2代变异植株继续延续真叶特别是心叶皱缩、叶缘不整齐、叶片变厚、变大、叶色变深、花瓣先端变钝、花瓣变长、变宽、花变大、颜色变深、籽粒变大的特征,而且变异新株系QP1-1-1和QXN-3-2植株生长势增强,株高分别比亲本高9.0 cm和7.4 cm,茎秆分别增粗0.13 cm和0.12 cm,叶面积分别增加133.0 cm2和103.0 cm2,叶片数分别减少15.0片和16.0片,主茎分枝分别增加1.6个和1.7个,生育期分别延长5 d和7 d,千粒重分别增加25.5 g和23.1 g,结实率分别下降了2.2%和4.7%(表5)。田间鉴定显示了多倍体特性。C 2～C 4连续3代鉴定,形态特征和农艺性状趋于一致,说明四倍体甜荞遗传稳定。

2.3 多倍体花粉粒、气孔、保卫细胞和染色体

实验室观察变异新株系QP 1-1-1和QXN-3-2的花粉粒比各自亲本分别增大9.6 μm×13.8 μm和9.6 μm×11.3 μm;叶片保卫细胞分别增大5.5 μm×5.3 μm和4.3 μm×3.3 μm;气孔密度分别下降38个/mm2和35个/mm2,幅度大(表6)。变异新株系QP 1-1-1和QXN-3-2种子根尖细胞染色体数均为2 N=4 X=32,而各自亲本染色体数均为2 N=2 X=16用0.1%、0.2%和0.3%的秋水仙素水溶液分别处理亲本二倍体甜荞品种(染色体2 N=2 X=16)干种子、发芽种子、幼苗,均能获得生育期更长、株高增加、茎秆增粗、叶片增大、籽粒显著增大、结实率有所下降的四倍体甜荞(染色体2 N=4 X=32)。说明,到目前为止,秋水仙素仍然是诱导荞麦染色体加倍的较好药物。在处理总数相同的情况下,处理干种子法虽然简单易行,方便操作,死亡株(16株)少,但加倍率(19.4%)最低;处理发芽种子法也操作简单方便,加倍率(52.7%)最高,但死亡株数(76株)也最高;处理幼苗法虽然操作繁琐,还要求操作者有一定技术水平,并且易受雨、风、苗情等外界因素影响,但加倍率(45.5%)较高,成活株(110株)也多,况且通过采取调节密度、出苗后处理时遇雨打伞、处理后单株幼苗盖上大小合适的玻璃杯等措施,可以避免或减少外界环境因素影响。几种方法比较结果,处理幼苗法是创制同源四倍体甜荞新种质的最有效方法,且0.2%秋水仙素水溶液处理幼苗效果最佳。四倍体甜荞与亲本比较,生育期延长、株高增高、结实率下降,所以在进行多倍体甜荞选育时应选择生育期较短、矮秆、结实率较高的二倍体甜荞做亲本。

注:K为QP 1-1-1染色体;L为对照品种甜荞1号染色体;M为QXN-3-2染色体;N为对照西农9976染色体。图2 秋水仙素诱导甜荞染色体Fig.2 Chromosome induction of common buckwheat by colchicine

表4 处理时期(A)与药物浓度(B)的共同效应Table 4 Common effects of treatment period (A) and drug concentration (B)

表5 甜荞四倍体株系和二倍体品种性状比较(10株平均值)Table 5 Comparison of traits between tetraploid lines and diploid varieties of common buckwheat (mean of 10 plants)

(图2和图3)。室内鉴定变异新株系QP 1-1-1和QXN-3-2显示了多倍体特性。连续3代镜检,新株系QP 1-1-1和QXN-3-2根尖细胞中的染色体数目保持不变,说明四倍体甜荞遗传稳定。

表6 甜荞四倍体品系和二倍体品种花粉粒、保卫细胞和气孔密度Table 6 Pollen grains, guard cells and stomatal density of tetraploid lines and diploid varieties of common buckwheat

3 结论与讨论