高效液相色谱法测定苦丁茶中孔雀石绿残留量

范志平，陈红霞，兑靖冬，范子玮，张娟娟，谢 勇，聂 立

（1. 宜宾市食品药品检验检测中心，四川宜宾 644600；2. 四川省药品监督管理局中药质量控制重点实验室，四川 宜宾 644600；3. 铜仁学院 材料与化学工程学院，贵州 铜仁 554300）

0 引言

苦丁茶属于冬青科冬青属植物，又称茶丁、富丁茶、皋卢茶等。主要分布在我国西南地区及华南地区。其成品茶清香有苦味，具有清热消暑、生津止渴、健胃消积、预防炎症等保健功能，目前苦丁茶已成为人们日常生活中的一种天然植物饮料[1-8]。

孔雀石绿别名孔雀绿、碱基绿，是一种三苯甲烷类绿色染料，曾用于制陶、印染、皮革、生物染色等方面，由于其具有有效的杀菌效果，曾被用来预防和治疗水产品真菌或细菌感染，但对人体会产生极大的危害性，具有致癌、致畸和致突变的作用，同时孔雀石绿在水产品物内可代谢为隐色孔雀石绿，其毒性更大[9-16]。鉴于此，许多国家已经将孔雀石绿及其代谢物列为水产养殖的禁用药物，我国在2019 年发布《农业农村部公告第250 号》明确规定，孔雀石绿属于食品动物中禁止使用的药品及其他化合物[17-18]。目前，国家现有标准和国内外文献关于孔雀石绿分析检测的品种主要有养殖水体、水产品、饲料和淀粉制品[19-27]。

近年来，在市场监管部门送检的苦丁茶中发现有不法人员使用孔雀石绿对其进行染色，使其颜色更加鲜绿诱人，以谋取不法利益。但目前国家标准及国内外文献都没有高效液相色谱法测定苦丁茶中孔雀石绿及其代谢物，因此需要建立一种准确度好、灵敏度高的方法测定苦丁茶中的孔雀石绿及其代谢物的含量，可以更好地为市场品监管部门严厉打击苦丁茶中非法添加孔雀石绿提供有利的技术保障。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260 型高效液相色谱仪（配备四元泵、柱温箱、自动进样器、配紫外-可见光检测器），美国安捷伦公司产品；电子天平，METTLER TOLEDO；涡旋振荡器，MX-S SciloGEX；高速离心机，四川蜀科仪器有限公司产品；TSC-II 型氮吹仪，广州泰思科学仪器有限公司产品；pH 计（PHSJ-4A），上海雷磁产品。

固相萃取柱：MCX 阳离子交换柱，60 mg/3 mL；孔雀石绿标准储备液（100 μg/mL，1.0 mL）、隐色孔雀石绿标准储备液（100 μg/mL，1.0 mL），农业部环境保护科研检测所提供。

样品为市场购买的苦丁茶，将样品混匀后用料理机粉碎，过20 目筛，密封，作为试样。阴性样品为市售样品中筛选出不含待测组分的试样；阳性样品为市售样品中筛选出含待测组分的试样。

1.2 标准溶液配制

混合标准中间液（孔雀石绿1 μg/mL；隐色孔雀石绿3 μg/mL）：分别准确吸取孔雀石绿标准储备液0.10 mL、隐色孔雀石绿标准储备液0.30 mL 置于同一个10 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成混合标准中间液，-18 ℃下避光保存。

混合基质标准溶液的制备：称取5 份均质混匀的空白基质各2 g（精确至0.001 g） 置于50 mL 具塞塑料离心管中，加入混合标准中间液30，60，120，240，360，600 μL，加入10 mL 2%乙酸水溶液，涡旋混匀，浸泡30 min，余下操作同样品处理。

1.3 样品处理

准确称取2 g（精确至0.001 g） 试样置于50 mL具塞塑料离心管中，加入10 mL 2%乙酸水溶液，涡旋混匀，浸泡30 min。加入10 mL 2%乙酸乙腈溶液，混匀，于涡旋振荡器上涡旋1 min，以转速4 000 r/min 离心4 min，取上清液转移至50 mL 容量瓶中，重复上述操作提取2 次，提取液置同一容量瓶中，用2%乙酸乙腈溶液定容至刻度，摇匀，准确吸取10 mL 置于玻璃氮吹管中，于45 ℃下氮吹至约2 mL，待净化。

净化：将上述溶液以低于1.0 mL/min 的流速加载在固相萃取小柱上，再依次用2 mL 水、2 mL 2%甲酸水溶液和2 mL 甲醇淋洗小柱，弃去淋洗液，真空抽干2 min，用3 mL 5%氨水甲醇溶液进行洗脱，收集洗脱液至玻璃氮吹管。洗脱液在45 ℃下氮气流吹干，加入2 mL 2%乙酸乙腈溶液溶解残渣，样液过0.22 μm 滤膜后，供液相色谱仪测定。

1.4 液相色谱分析条件

液相色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18（4.6 mm×250 mm，5 μm） 色谱柱；柱后氧化柱规格35 mm×4.6 mm，填料类型为硅藻土∶二氧化铅=3∶1。

流动相：(A)20 mmol/L 乙酸铵溶液（pH 值4.5），(B)乙腈，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量50 μL，检测波长618 nm。

梯度洗脱参考条件见1。

表1 梯度洗脱参考条件

2 结果与分析

2.1 样品提取是否加水浸泡的优化

考虑到孔雀石绿与隐色孔雀石绿均为弱碱性化合物，为了提高待测组分的提取效率，试样初步采用含酸乙腈溶液提取。试验考查了不加水浸泡2%乙酸乙腈提取、加水浸泡后再用2%乙酸乙腈提取、加入2%乙酸水浸泡后再用纯乙腈提取，以及加入2%乙酸水浸泡后再用2%乙酸乙腈提取4 种方式浸泡阳性样品。

样品提取是否加水浸泡的优化结果见图1。

图1 样品提取是否加水浸泡的优化结果

试验结果表明，先将样品加入2%乙酸水浸泡后再用2%乙酸乙腈提取，测得样品待测组分含量最高。分析原因，其一由于干茶叶粉末对待测组分有一定的吸附性，在用2%乙酸乙腈提取前先用乙酸水溶液浸泡，减小了茶叶的吸附性，从而提高了提取效率；其二，孔雀石绿及隐色孔雀石绿呈弱碱性，在水和乙腈中加入一定量的乙酸有利于孔雀石绿的溶出。因此，选择先用2%乙酸水浸泡，再用2%乙酸乙腈提取。

2.2 加2%乙酸水溶液浸泡时间的优化

试验考查了加2%乙酸水浸泡0，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 h 及浸泡过夜7 种浸泡时间对待测组分测定结果的影响。

不同浸泡时间对待测组分含量的影响见图2。

图2 不同浸泡时间对待测组分含量的影响

结果表明，浸泡时间长短对孔雀石绿和隐色孔雀石绿的测定几乎无影响，为节约试验时间，同时又保证待测组分的溶出，加2%乙酸水溶液浸泡的时间选择0.5 h。

2.3 提取溶剂的优化

由于孔雀石绿与隐色孔雀石绿均为弱碱性，考虑在提取溶剂乙腈中加入适量有机酸使提取液呈弱酸性，更利于孔雀石绿和隐色孔雀石绿的溶出。通过试验比较纯乙腈溶液，0.1%甲酸乙腈，0.2%甲酸乙腈，0.5%甲酸乙腈，1%甲酸乙腈，、0.2%乙酸乙腈，0.5%乙酸乙腈，1%乙酸乙腈，2%乙酸乙腈9 种提取溶剂。

不同提取溶剂对待测组分含量的影响见图3。

图3 不同提取溶剂对待测组分含量的影响

试验结果表明，甲酸乙腈溶液提取时，待测组分峰形较差，乙酸乙腈溶液提取时，待测组分峰形较好，且乙酸质量分数为2% 时，测得阳性样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿的含量都较高。因此，选择2%乙酸乙腈溶液作为提取溶剂。

2.4 提取方式的优化

试验考查了均质1 min、超声30 min、涡旋提取1 min 和加入均质子涡旋1 min 4 种提取方式。

不同提取方式对待测组分含量的影响见图4。

图4 不同提取方式对待测组分含量的影响

试验结果表明，4 种提取方式对孔雀石绿和隐色孔雀石绿的测定几乎无影响，为节约试验时间且考虑操作简单，选择涡旋1 min 的提取方式。

2.5 涡旋时间的优化

试验考查了0，15，30，60，90，120 s 6 种涡旋时间的提取效果。

不同涡旋时间对待测组分含量的影响见图5。

图5 不同涡旋时间对待测组分含量的影响

试验结果表明，涡旋时间达到30 s 以上时，孔雀石绿和隐色孔雀石绿的含量几乎无明显差异，为节约试验时间，同时又保证待测组分的充分溶出，试验选择涡旋时间1 min。

2.6 流动相的选择

考查了乙腈作为有机相，不同浓度的乙酸铵溶液（20，40，60，80，100 mmol/L） 作为水相时，对待侧化合物峰形及灵敏度的影响。结果表明，当乙腈作为有机相，20 mmol/L 乙酸铵溶液作为水相时，各待测化合物响应好、灵敏度高、峰形好，随着乙酸铵浓度的增加，孔雀石绿和隐色孔雀石绿的峰形变差，响应变小， 故采用乙腈-20 mmol/L 乙酸铵溶液作为流动相。试验考查了不同pH 值的乙酸铵溶液（pH 值3.5，pH 值4.5，pH 值5.5，pH 值7.5） 对待测化合物的影响，结果表明，水相具有一定酸性可有效改善各待测化合物的峰形，提高分离度，以及提高待测化合物的响应。当乙酸铵溶液的pH 值为4.5 时，各待测化合物的峰形好、灵敏度高、响应好。因此，采用乙腈-20 mmol/L 乙酸铵溶液（pH 值4.5） 作为流动相。

2.7 采用空白基质标准溶液定量的必要性

以苦丁茶为基质，进行加标回收试验。准确称取2 g 粉碎后阴性样品，添加孔雀石绿和隐色孔雀石绿标准品，制成孔雀石绿添加水平为15，30，150 μg/kg的样品各6 份，隐色孔雀石绿添加水平为45，90，450 μg/kg 的样品各6 份，按12.3 方法，分别采用裸标和空白基质标准溶液2 种定量方式进行加样回收试验和精密度试验；由表2 可知，孔雀石绿采用裸标定量方式的3 种添加水平的平均回收率均偏低，而隐色孔雀石绿采用裸标定量方式的3 种添加水平的平均回收率均偏高，不满足食品补充检验方法编制技术的要求；由表3 可知，孔雀石绿采用空白基质标准溶液定量方式，3 种添加水平的平均回收率为96.7%～111.4%，相对标准偏差为1.1%～4.6%，隐色孔雀石绿采用空白基质标准溶液定量方式，3 种添加水平的平均回收率为99.7%～103.9%，相对标准偏差为2.2%～5.8%，均满足GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》规定。综上所述，选取空白基质标准溶液定量的方式。

孔雀石绿及隐色孔雀石绿采用裸标定量方式的加标回收率和相对标准偏差（RSD） （n=6） 见表2，孔雀石绿及隐色孔雀石绿采用空白基质标准溶液定量方式的加标回收率和相对标准偏差（RSD）（n=6） 见表3。

表2 孔雀石绿及隐色孔雀石绿采用裸标定量方式的加标回收率和相对标准偏差（RSD） （n=6）

表3 孔雀石绿及隐色孔雀石绿采用空白基质标准溶液定量方式的加标回收率和相对标准偏差（RSD） （n=6）

2.8 方法的线性范围

取孔雀石绿质量浓度为3，6，12，24，36，60 ng/mL 的系列基质标准溶液和隐色孔雀石绿质量浓度为9，18，36，72，108，180 ng/mL 的系列基质标准溶液，在已优化的色谱条件下，以峰面积比（Y） 对相应的质量浓度比（X） 作图，绘制标准曲线（见图6），并计算各待测物线性回归方程及其相关系数。在相应的质量浓度范围内，孔雀石绿和隐色孔雀石绿线性关系良好，相关系数R均在0.990 以上，分别对苦丁茶中添加孔雀石绿5 μg/kg 和隐色孔雀石绿15 μg/kg 时，信噪比均大于10，因此最终确定该方法的定量限：孔雀石绿5 μg/kg 和隐色孔雀石绿15 μg/kg。

孔雀石绿和隐色孔雀石绿的基质加标工作液液相色谱图见图6，孔雀石绿和隐色孔雀石绿在基质中的保留时间和线性关系见表4。

图6 孔雀石绿和隐色孔雀石绿的基质加标工作液液相色谱图

表4 孔雀石绿和隐色孔雀石绿在基质中的保留时间和线性关系

2.9 实际样品的测定

采用该方法对从市场购买的苦丁茶共计13 批次进行测定，结果发现，2 份苦丁茶样品中检出孔雀石绿残留。

实际样品测定情况见表5。

表5 实际样品测定情况

3 结论

采用高效液相色谱技术建立了苦丁茶中孔雀石绿及其代谢物的测定方法，方法对提取溶剂、提取方式及液相色谱条件进行了研究。方法回收率和相对标准偏差均能够符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》规定，可有效为食品安全监管提供更有力的技术支撑。