无果枸杞叶茯茶加工过程中活性成分及体外抗氧化作用

段 洁，孙 敏，边文文，刘 静，曾 桥，赵文强，余郑绿，谷文军，刘国祥

（1. 陕西省产品质量监督检验研究院，陕西 西安 710048；2. 陕西农产品加工技术研究院，陕西西安 710021；3. 陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西西安 710021；4. 陕西朴道茶业股份有限公司，陕西 西安 713700；5. 宁夏童子茶科技有限公司，宁夏 中卫 755100）

枸杞属茄科落叶灌木植物[1]，宁夏枸杞是中国枸杞属植物中唯一被载入《中国药典》的品种，常于夏、秋二季果实呈红色时采收，经干燥后入药，其性味甘，平，归肝、肾经，具有滋补肝肾、益精明目的作用，常用于治疗虚劳精亏、腰膝酸痛、眩晕耳鸣、内热消渴、血虚萎黄、目昏不明等[2]。无果枸杞是宁夏枸杞与野生枸杞嫁接培育的新品种，现有研究表明，无果枸杞的芽和叶含有丰富的多酚、多糖、黄酮及氨基酸等活性成分[3]，其含量随季节不同而有较大差异，由于不开花和结果，故其嫩梢和叶中的营养活性成分较普通枸杞叶更高。药理研究表明，无果枸杞叶提取物具有较好的抗氧化、抗衰老、降血脂和预防老年性痴呆症等作用[3，5]，因而具有较高的开发利用价值。当前，对无果枸杞叶的利用以枸杞叶茶最为常见，然而现有枸杞叶茶普遍存在滋味苦涩、青辛味较重等缺点，由于口感较差，因而尚未得到市场广泛认可。

茯茶为黑茶类全发酵茶，是以黑毛茶为原料，经冠突散囊菌为主的多菌群发酵制作而成，具有金花普茂、菌香浓郁、汤色红浓、口感醇厚的独特特征和风味，品质较加工前显著提升[5]。为此，前期以采摘于宁夏中宁的无果枸杞嫩梢和叶为原料，经杀青、干燥等工艺制成枸杞叶茶，进一步与黑毛茶拼配，并采用泾阳茯茶加工工艺制成枸杞叶茯茶，不仅改善了枸杞叶茶的口感，而且丰富了茯茶产品类型。在枸杞叶茯茶成功制作的基础上，对枸杞叶茯茶加工过程中主要活性成分的变化及发花后枸杞叶茯茶抗氧化作用进行了研究，从而为枸杞叶茯茶的饮用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枸杞叶茶以采摘于宁夏中宁无果枸杞嫩梢和叶为原料，宁夏童子茶科技有限公司加工制作而成；黑毛茶产自湖南石门，陕西朴道茶业股份有限公司提供；枸杞叶茶和黑毛茶按1∶1 拼配混匀，经拣选、拌釉渥堆、气蒸（9～12 s）、压制成型、发花、干燥等工艺制成。

分别在加工过程中的原料拣选、拌釉渥堆、气蒸与压制成型（即发花0 d），发花8 d 和25 d 取样，所有样本均取样约200 g，依次编号为S1～S5，取样后立即进行冷冻干燥处理，均匀磨碎后贮藏于-20 ℃下备用。

芦丁、葡萄糖、没食子酸、咖啡碱、谷氨酸标准品，上海源叶生物科技有限公司提供；浓盐酸、浓硫酸、水合茚三酮（均为分析纯），国药集团化学试剂有限公司提供；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、苯酚、福林酚、碳酸钠、甲醇、碱式乙酸铅、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化亚锡、乙酸乙酯、草酸、碳酸氢钠、硫酸亚铁、过氧化氢、水杨酸、过硫酸钾（均为分析纯），天津市科密欧化学试剂有限公司提供；1,1 -二苯基- 2 -三硝基苯肼（DPPH）、ABTS 二胺盐，上海源叶生物科技有限公司提供。

1.2 仪器与设备

TU-1810 型紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司产品；FA1004N 型电子分析天平，上海精科天平有限公司产品；TG16-WS 型台式低速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品；RE52CS-1 型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂产品；GZX-9246MBE 型电热鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品；TD5A 型大容量低速离心机，长沙英泰仪器有限公司产品；HH-2 型电热恒温水浴锅，金坛市江南仪器厂产品；FD5-2.5 型冷冻干燥机，美国SIM 公司产品。

1.3 方法

1.3.1 枸杞叶茯茶活性成分分析

水浸出物含量，参考GB/T 8305—2013《茶 水浸出物测定》进行测定；多糖含量，参考文献[6]进行测定；总黄酮含量，参照文献[7]进行测定；游离氨基酸含量，参考GB/T 8314—2013《茶 游离氨基酸总量的测定》进行测定；咖啡碱含量，参考GB/T 8312—2013《茶咖啡碱测定》进行测定；多酚含量，参考GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》进行测定；茶色素含量，参考文献[8]进行测定。

1.3.2 体外抗氧化作用研究

（1） 枸杞叶茯茶水提取物母液制备[9-11]。称取2.0 g 贮藏于-20 ℃下的发花25 d 枸杞叶茯茶冻干样本，加40 mL 沸水，沸水浴提取45 min，期间每15 min 振摇1 次，趁热抽滤，滤渣重复提取1 次，合并滤液置于100 mL 容量瓶中，定容至刻度，即得质量浓度为20 mg/mL 的枸杞叶茯茶水提取物母液，待用。

（2） ABTS+清除活性测定。参照文献[12]的方法稍作改进。等体积混合ABTS+溶液（8.1 mmol/L） 与过硫酸钾溶液（3.2 mmol/L），暗处放置16 h，进一步用无水乙醇稀释至在波长734 nm 处吸光度（A）为0.70 左右，得ABTS+工作液。取一定体积枸杞叶茯茶水提取物母液，分别稀释至质量浓度为5，10，20，30，40，50，80 μg/mL，取上述稀释后不同质量浓度枸杞叶茯茶提取液1 mL 置于具塞试管中，每管加入ABTS+工作液4.0 mL，室温下避光反应6 min，于波长734 nm 处测定吸光度（A），记为A样品；以蒸馏水代替枸杞叶茯茶提取液为空白组，测定吸光度（A） 记为A空白，按照公式（1） 计算ABTS+清除率。同时，以维C 为阳性对照。

（3） DPPH 自由基清除活性测定。参照文献[10]的方法稍作改进。取一定体积枸杞叶茯茶水提取物母液，分别稀释至质量浓度为20，30，40，50，70，100 μg/mL，取上述稀释后不同质量浓度枸杞叶茯茶提取液2 mL 置于具塞试管中，各管加入0.1 mmol/L DPPH 溶液2 mL，混匀后于室温下静置30 min，于波长517 nm 处测定吸光度（A） 记为A样品。用蒸馏水代替DPPH 溶液按照上述方法操作，测定吸光度（A） 记为A对照，以蒸馏水代替枸杞叶茯茶提取液按上述方法操作，测定吸光度记为A空白，按照公式（2） 计算DPPH 自由基消除率。同时，以维C 为阳性对照。

（4）·OH 清除活性测定。参照文献[11]的方法稍作改进。将枸杞叶茯茶水提取物母液梯度稀释为0.01，0.05，0.10，0.40，0.80，1.60，2.40，3.20 mg/mL。于不同试管中分别加入上述不同质量浓度枸杞叶茯茶提取液2 mL，再依次加入2 mL 的9 mmol/L 的FeSO4、水杨酸和8.8 mmol/L 的H2O2溶液，摇匀，于37 ℃下水浴30 min，以蒸馏水调零，于波长510 nm 处测吸光值，记为A样品。以蒸馏水代替枸杞叶茯茶提取液按上述方法操作，测定吸光度记为A空白；用蒸馏水代替水杨酸按上述方法操作，测定吸光度记为A对照，按照公式（3） 计算·OH 清除率。同时，以维C为阳性对照。

1.4 数据处理

所有试验均重复3 次，利用Excel 软件进行数据处理，结果用平均值±标准差表示，利用Graph Pad Prism 软件进行进行显著性分析和绘图。采用Metabo Analyst 5.0 进行主成分分析（Principle component analysis，PCA）。

2 结果与分析

2.1 枸杞叶茯茶不同加工阶段活性成分变化

枸杞叶茯茶加工过程中水浸出物、总黄酮、多糖、多酚、游离氨基酸、咖啡碱、茶色素等活性成分进行分析。

枸杞叶茯茶不同加工阶段活性成分分析见表1。

由表1 可知，枸杞叶茯茶中活性成分较为丰富，在所检测的活性成分中除茶褐素外，其余成分在加工过程中均呈下降趋势，与传统以黑毛茶为原料加工茯茶变化规律相似[12]。与S1 相比，发花结束后样本S5 中水浸出物、总黄酮、多糖、多酚、游离氨基酸、咖啡碱、茶红素分别下降8.54%，22.79%，20.35%，12.16%，39.31%，23.70%和37.90%，而茶褐素增加37.50%，且差异均达到显著水平（p＜0.05）。

表1 枸杞叶茯茶不同加工阶段活性成分分析

进一步对各主要活性成分分析可以发现，在枸杞叶茯茶加工程中，水浸出物主要在渥堆阶段（S1～S2） 和发花中后期（S4～S5） 下降较快，分别下降1.82%和0.79%，上述2 个阶段水浸出物下降量占加工过程总下降量的76.54%，可能是由于在渥堆和发花中后期这2 个阶段，微生物的生长繁殖消耗了大量的营养成分而导致。枸杞叶茯茶原料中黄酮含量高达11.63%，发花结束后含量仍达8.98%，远高于传统茯茶[12]。总黄酮在渥堆阶段呈下降趋势，但S1和S2 差异不显著（p＞0.05），发花阶段下降明显，尤其以S3～S4 阶段下降幅度最大，此过程中总黄酮含量减少1.45%，下降幅度为13.19%，差异达极显著水平（p＜0.01），发花后期（S4～S5） 下降有所减缓，但S4 和S5 中总黄酮含量差异仍达极显著水平（p＜0.01）。多糖在枸杞叶茯茶加工过程中下降明显，各不同阶段样本间多糖含量均差异显著（p＜0.05），其中以气蒸阶段下降幅度最大，发花阶段次之，且S2 与后续各阶段样本，S3 与S5、S4 与S5 之间含量差异达极显著水平（p＜0.01）。枸杞叶茯茶加工过程中多糖含量显著降低的原因可能是由于糖类物质一方面在高温高湿下易发生脱水、缩合、聚合等焦糖化反应，另一方面作为以冠突散囊菌为主的多菌群生长和繁殖的碳源而被消耗所导致[13]。游离氨基酸在枸杞叶茯茶加工过程中的各个阶段含量均下降明显，其在各不同阶段样本间的含量差异不仅显著（p＜0.05），而且均达到极显著水平（p＜0.01）。研究表明，氨基酸主要赋予茶叶鲜爽的口感，而醇和是茯茶的主要特征，因此其含量的下降有助于枸杞叶茯茶品质形成。枸杞叶茯茶加工过程中，咖啡碱含量下降主要集中于渥堆和气蒸阶段，与S1 相比，S3 中咖啡碱含量下降幅度达19.36%，在发花后期，咖啡碱含量下降幅度大大降低。咖啡碱是茶叶中苦味物质之一，其在加工过程中含量的降低有助于缓解茶汤苦涩味；同时，咖啡碱还可与黄酮类氧化产物形成络合物，有助于枸杞叶茯茶醇和滋味的形成。茶多酚是茶叶中主要的抗氧化活性物质，在枸杞叶茯茶加工过程中多酚的含量变化明显，总体来看，加工前期（S1～S3） 多酚含量下降幅度较发花阶段（S3～S5） 小。除S1 和S2 阶段多酚含量差异不显著外（p＜0.05），S1 和S2 与其他阶段样本中多酚含量差异均达到显著水平（p＜0.05），且S1 和S3，S4 和S5，S2和S4 和S5，S3 和S5 的含量差异达极显著水平（p＜0.01）。多酚和茶叶的苦涩味有较为密切的关系，其在加工过程中含量的下降有助于降低枸杞叶茯茶的粗涩味，增进其醇和口感。此外，随着枸杞叶茯茶加工过程的进行，茶多酚经酶促氧化或非酶促氧化形成茶色素，进一步多酚、茶黄素、茶红素聚合形成茶褐素。因此，在枸杞叶茯茶加工过程中，茶红素逐步下降，而茶褐素逐步上升，且各不同阶段样本间茶红素和茶褐素含量差异均达到极显著水平（p＜0.01），茶红素和茶褐素含量的变化使得枸杞叶茯茶不同阶段样本冲泡后汤色由黄绿逐步转变橙黄，最终为橙红。

2.2 主成分分析

不同加工阶段枸杞叶茯茶活性成分主成分分析见图1。

图1 不同加工阶段枸杞叶茯茶活性成分主成分分析

对枸杞叶茯茶加工过程中各不同阶段样本活性成分进行主成分分析，可直观地反映各样本活性成分的差异。由图1 可知，枸杞叶茯茶不同加工阶段活性成分PCA 图中PC1 为88.97%，PC2 为5.65%，二者累计贡献率为94.62 %，表明PC1 和PC2 的总贡献率包含了枸杞叶茯茶样本的大部分信息，较好地反映了不同茶样之间活性成分差异的影响因素。枸杞叶茯茶各不同加工阶段样本在PCA 图上均呈现明显的分离，说明茶样主要活性成分在加工过程中发生了较大的变化，活性物质能够得到良好的分离。

2.3 枸杞叶茯茶水提取物体外抗氧化活性

2.3.1 ABTS+自由基清除作用

不同质量浓度枸杞叶茯茶水提取物对ABTS+自由基清除作用见图2。

图2 不同质量浓度枸杞叶茯茶水提取物对ABTS+自由基清除作用

由图2 可知，枸杞叶茯茶水提取物对ABTS+自由基具有较好的清除作用，但其清除能力较维C 弱。当枸杞叶茯茶水提取物质量浓度为5 μg/mL 时，其对ABTS+自由基的清除率为8.85%，随着水提取物质量浓度的增大，其对ABTS+自由基的清除作用逐步增强。当枸杞叶茯茶水提取物质量浓度为50 μg/mL 时，其对ABTS+自由基的清除率为34.96%，继续增大水提物浓度，其对ABTS+自由基的清除率增加不明显，当水提物质量浓度为80 μg/mL 时，与50 μg/mL 相比，清除率仅增加3.09%。

2.3.2 DPPH 自由基清除作用

不同质量浓度枸杞叶茯茶水提取物对DPPH 自由基清除作用见图3。

图3 不同质量浓度枸杞叶茯茶水提取物对DPPH 自由基清除作用

由图3 可知，枸杞叶茯茶水提取物具有较好的DPPH 自由基清除作用，但其清除能力较维C 弱。当枸杞叶茯茶水提取物质量浓度为20 μg/mL 时，其对DPPH 自由基的清除率为20.81%，随着质量浓度的增大，清除率逐步增加，当质量浓度达100 μg/mL时，其对DPPH 自由基的清除率可达64.04%。在20～100 μg/mL 范围内，枸杞叶茯茶水提取物质量浓度与DPPH 自由基的清除率呈线性正相关，拟合方程为Y=0.005 2X+ 0.129 8，R2=0.984 4，线性关系较好。通过该拟合方程可计算出枸杞叶茯茶水提取物对DPPH 自由基半抑制质量浓度（IC50） 为71.19 μg/mL。

2.3.3 对·OH 的清除作用

不同质量浓度枸杞叶茯茶水提取物对·OH 自由基清除作用见图4。

图4 不同质量浓度枸杞叶茯茶水提取物对·OH 自由基清除作用

由图4 可知，枸杞叶茯茶水提取物对·OH 具有一定的清除作用，当水提取物质量浓度为0.01 mg/mL时，其对·OH 自由基的清除率为4.19%，继续增加水提取物质量浓度，其对·OH 自由基清除率逐步增加。当水提取物质量浓度为0.4 mg/mL 时，其对·OH自由基清除率为9.09%；当质量浓度为2.4 mg/mL时，其对·OH 自由基清除率为30.93%；继续增加水提取物质量浓度至3.2 mg/mL，清除率为31.02%，上升幅度较小。在0.1～2.4 mg/mL 内，枸杞叶茯茶水提取物质量浓度与·OH 自由基的清除率之间呈正相关，拟合方程为Y=0.105 6X+0.048 0，R2=0.989 7，线性关系较好。

3 结论

枸杞叶茯茶加工过程中茶褐素含量呈上升趋势，而水浸出物、总黄酮、多糖、多酚、游离氨基酸、咖啡碱、茶红素等活性成分呈下降趋势，上述活性成分的变化对于促进枸杞叶茯茶醇和口感和橙红汤色等优良品质的形成具有一定作用。体外抗氧化研究结果表明，枸杞叶茯茶水提取物具有较好的抗氧化活性，其对DPPH，ABTS+，·OH 自由基的清除能力随水提取物质量浓度的增大而增大，呈现一定的剂量-效应关系，这为枸杞叶茯茶的饮用提供了参考。