宏基因组学技术在蔬菜发酵中的应用

张 令，罗 根，杨 岩，王泳俨，张美霞

（1. 重庆三峡学院 生物与食品工程学院，重庆 404120；2. 重庆文理学院园林与生命科学学院，重庆 402160）

1 发酵蔬菜发展概况

发酵蔬菜历史悠久，种类多样。四川泡菜、东北酸菜和东北辣白菜等都是日常生活中普遍食用的发酵蔬菜[1]。发酵蔬菜含丰富的益生菌、膳食纤维、维生素及微量元素等[2]。在发酵过程中利用原料本身携带的微生物，在密封厌氧的条件下进行无氧呼吸分解有机物产生相应的风味物质，使产品具有独特的风味、品质和营养价值，并深受广大百姓的喜爱[3-4]。

不同地区具有各自特色的发酵蔬菜，其制作工艺及环境条件的不同，使其在发酵过程中微生物群落结构、代谢途径及品质特征的变化也产生差异[5]。在蔬菜发酵过程中，原料本身含有丰富的蛋白质、多糖及脂肪等有机物在微生物的作用下进行酶解反应产生氨基酸、单糖、脂肪酸和多酚类化合物，使产品具有独特的风味及丰富的营养物质[6]。细菌在发酵过程中起着重要的作用，蔬菜发酵过程中高度依赖于天然存在的乳酸杆菌，会随着发酵的进行不断占据主导地位。而蔬菜发酵过程中也会存在常见的致病菌和腐败微生物，在蔬菜发酵初期中存在常见的致病微生物和腐败微生物，包括鞘氨醇单胞菌、假单胞菌和厌氧菌等，但这些真菌微生物在发酵早期迅速消失，可能是由于生态位选择[7]。因此，为了保证产品质量安全问题，必须对产品品质检测问题进行解决。

近年来，随着分子生物学技术的快速发展，发酵食品微生物的检测已不完全依赖于传统培养皿技术，高通量测序技术以高通量、低成本等优势在一定程度上不仅弥补了传统培养皿技术低效率、成本高等缺陷，还对产品质量检测的问题得到了很好的解决[8]。宏基因组测序技术以高效性、准确性强等优势能系统地挖掘微生物的菌系构成，并能有效地注释发酵菌系的代谢功能[9]。目前，宏基因组测序技术已应用于食品微生物、肠道微生物等领域的微生物群落研究中，为微生物群落结构的分析作出了巨大的贡献。以高通量测序技术的宏基因组技术为起点，综述了宏组学技术对四川泡菜、东北酸菜和东北辣白菜不同腌制环境中微生物群落多样性、结构和潜在基因功能的研究进展，以及各地区微生物菌群与品质之间的相关性分析，为宏基因组学技术在蔬菜发酵行业中微生物的检测和产品质量的优化提供理论支撑。

2 宏基因组学技术

2.1 宏基因组学技术概述

宏基因组学技术是一种基因组检测的新兴手段。组学技术可从分子层面解释宏观表象与基因、代谢等之间的关系，与传统方法相比具有显著的优势[10]。Handelsman J 等人[11]第1 次将宏基因组定义为环境中全部微生物群的所有遗传物质。其是以特定环境中的总DNA 为对象，通过对研究微生物群落结构多样性、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系，并进行比较分析来发掘潜在的生物学意义[12]。

在宏基因组学技术检测成本逐渐降低和测序准确度不断提升下，微生物群落的研究逐渐进入成熟阶段。该技术克服了传统培养皿技术只分离少数可培养微生物的困境，并且测序速度快、准确性强，更有利于低丰富群落物种的鉴定，从而提高微生物群落研究的完整性[12]。不仅提高了研究效率，还能得到丰富的微生物群落结构变化数据。通过生物信息分析后，可进行物种丰度、基因预测、基因功能注释等分析。目前，宏基因组测序广泛应用于土壤、人体、动物肠道、植物等领域，并取得了显著的成就[13]。例如，研究冬虫夏草对大鼠肠道菌群的影响中，通过对冬虫夏草注射和空白组大鼠的粪便进行宏组学测序，LEfSe 差异性分析和KEGG 功能注释显示出注射冬虫夏草的大鼠肠道菌群结构与代谢途径发现明显变化，结论得出注射冬虫夏草够促进益生菌生长，虫草多糖也可能会对肠道菌群产生影响，KEGG 显示CCs 可能通过调节肠道菌群增强抗肿瘤和免疫调节能力[14]。研究宏基因组学第2 代测序技术与传统实验室培养在脓毒症病原学诊断中进行对比，把入选的脓毒症患者的标本同时送检宏基因组学第2 代测序技术和实验室细菌培养。经过对结果进行对比分析后发现，宏组学技术在感染性疾病病原体的诊断方面时间更短、阳性率更高，并且在罕见病原体诊断准确性有显著优势，可缩短患者诊断时间[15]。研究黄酒对D -半乳糖致衰老小鼠模型肠道微生物菌群的影响中，通过在黄酒的干预下对肠道细菌16S rDNA 基因进行测序。结果表明，在黄酒的干预下致衰老鼠抗氧化酶活性升高，丙二醛下降，并显著干预了致衰老鼠的认知能力和微生物菌群结构[16]。

宏基因组学技术以高效性、低成本等优点可以解决许多微生物不可培养的问题，在一定程度上也打破了人们对于微生物菌群认知的局限性，促进了人们在宏观上对微生物群落多样性、结构及演替相互作用上的深入研究，并有利于人们能够更好地了解微生物环境的群落结构。

2.2 高通量测序技术在宏基因组学中的应用

随着高通量测序技术的发展，其技术特点以高通量、高效率、低耗材等优势在微生物研究领域中迅速发展[17]。20 世纪70 年代中期，Sanger 建立的双脱氧末端终止法被广泛使用，其核心技术采用96 孔毛细管电泳。第1 代测序技术具有读长较长、准确率高达99.999%的特点，但是仍存在通量小、耗时长和成本高等技术缺点[18]。第2 代测序技术是以高通量测序技术为依托，包括焦磷酸合成法、磁珠的连接测序法、边合成边测序法，其核心技术采用边连接合成边测序，技术特点与第1 代Sanger 测序技术相比在一定程度上弥补通量低和成本高等缺陷，并很快在不同领域中被广泛应用[19]。而第3 代测序技术是以SMRT 芯片为测序载体，依赖零级模波导的纳米结构观察核酸的聚合。其技术特点集通量高、低成本等多种优点于一身的新型测序技术，为深入研究微生物群落提供了新的途径[20]。

2.3 宏基因组学技术在发酵食品微生物群落中的应用

发酵食品种类多样，酒精饮料、乳制品、豆制品、酱腌菜、调味品等都是发酵食品中常见的产品[21]。由于发酵食品中的微生物是一个复杂集体，在发酵食品生产过程中微生物群落结构特征、演替变化规律和功能基因的研究尚少，导致食品安全问题在日常生活中频频出现。

发酵食品中品质和风味等重要表观因素受微生物菌群结构变化影响较大[22]。发酵食品在后熟过程中的蛋白质、糖、脂肪等物质为基质进行发酵，形成氨基酸、醇、醛、酮、酯等成分并不断发生化学反应，相互协同作用使发酵食品具有特殊的色香味，而发酵食品风味物质的形成主要包括原料基质的水解反应、微生物代谢产物的合成反应或酶催化各分子进行的生化反应，所以对微生物菌群的研究有助于优化产品品质[23]。例如，以不同发酵阶段的羊肉香肠为研究对象，分别采用高效液相色谱法和宏基因组技术测定发酵过程中生物胺含量变化和微生物群落演替，并对发酵微生物和酶的丰度与功能进行注释和相关性分析。结果发现，样品中8 种生物胺随着发酵时间的延长呈现先增加后降低的趋势，其中精氨酸含量最高。样品中鉴定出大量微生物，细菌中的葡萄球菌属、弧菌属、酒球菌属和嗜血杆菌属为优势菌属。通过Spearman 相关性分析显示出生物胺与微生物部分细菌属具有相关性，通过KEGG 数据库分析得出生物胺的代谢与微生物和酶具有相互作用[24]。因此，宏基因组测序数据能够直观地对发酵食品微生物群落多样性进行解析。同时，通过生信分析数据处理后能够对微生物群落结构及功能基因代谢途径变化的相关性分析研究起到重要作用。

目前，随着宏基因组学技术的出现，已经在许多领域上挖掘出尚未发现的微生物群落结构变化规律、功能性基因，以及更多不可培养微生物，为生物发酵工程等微生物应用领域研究提供巨大贡献。但是在蔬菜发酵行业微生物研究领域中仍存在一些难以解决的问题，并限制了蔬菜发酵行业的迅速发展。所以，该技术在蔬菜发酵中是一个很有前景但仍尚未充分开发的领域。

3 宏基因组学技术在蔬菜发酵中的应用

在发酵蔬菜漫长的研究过程中，发现研究领域中主要涉及产品的品质、风味及微生物菌群结构等[25]。产品品质的研究主要有亚硝酸盐、蛋白质、氨基酸、粗纤维、总酸、挥发性风味物质等，蛋白质、粗纤维在发酵过程中会受到微生物的作用下分解为相应的氨基酸等物质，并释放一定的能量改变发酵过程中封闭的内部条件，改变微生物衍生替代，从而微生物代谢产生的物质会对产品的风味造成相应的影响。近年来，宏基因组学技术已应用于蔬菜发酵过程中的微生物菌群研究，并产生了一定的成果。

3.1 在四川泡菜生产中的应用

四川泡菜是一种盐泡渍发酵蔬菜，其含有丰富膳食纤维及B 族维生素等营养物质[26]。在发酵过程中会产生乳酸，能刺激消化腺分泌消化液，从而促进食物消化吸收。泡菜大多味道酸甜、爽口，能提升食欲，且泡菜中的生蒜、生姜、辣椒等成分不仅能杀菌，还能促进身体新陈代谢，有促排汗的作用。泡菜的热量较低，含有的膳食纤维可加快肠道蠕动，预防便秘[27]。

陆晓晴等人[28]通过对25 ℃泡菜自然发酵过程中微生物菌群消长规律的研究中发现泡菜的可溶性蛋白质经过几天，可溶性蛋白持续下降，但速度明显减缓，逐渐到达一个稳定状态。史梅莓等人[29]通过人工接种3 种单菌及多菌对多轮发酵四川泡菜品质的影响中发现，接种后的四川泡菜可以加快发酵速度，品质更加稳定。钱杨等人[30]以4 种原料（萝卜、豇豆、辣椒及混合蔬菜） 分别发酵四川泡菜，采用高通量测序技术对不同蔬菜原料四川泡菜中微生物多样性进行分析。结果表明，辣椒泡菜中的微生物多样性最丰富，豇豆泡菜中微生物多样性最低，萝卜泡菜和混合泡菜中共同含有5 种细菌属。在分析微生物菌群与理化因子的相关性的研究中显示，辣椒泡菜中微生物与pH 值相关性最强，豇豆泡菜中微生物与醋酸相关性最强。在发酵过程中高浓度盐和微生物菌株的产酸能力能够保证产品的品质，所以在泡菜发酵过程中产酸菌株为代表的盐球菌（Halococcus）、醋酸杆菌（Acidobacteriota） 和乳酸菌（Lactobacillus） 等可作为重要检测指标[31]。Mi T 等人[32]通过宏基因组测序技术研究盐浓度对自然发酵萝卜泡菜品质及微生物多样性的影响，在对泡菜中微生物菌群多样性的分析中发现，厚壁菌门（Firmicu-tes）、变形菌门（Proteobacteria） 和子囊菌门（Ascomycota）为主要菌门，魏斯氏菌属和乳杆菌属（Lactobacillus）为优势菌属。在风味物质检测出多种物质后与微生物菌群进行相关性分析，发现一些细菌属与风味物质显著性相关，而真菌与风味物质的相关性较弱。虽然乳酸杆菌在发酵过程中起到至关重要的作用，但是在发酵蔬菜中品质是由微生物之间相互作用决定的。发酵过程中微生物菌群组成存在明显差异，所以品质也会受到不同时期微生物菌群丰度的影响。这些研究结果，有助于在理解发酵蔬菜中微生物菌群的分布及与品质指标之间的相关性[33]。

3.2 在东北辣白菜生产中的应用

东北辣白菜以大白菜为主，通过加入食盐、白砂糖、辣椒粉等佐料腌制而成[34]。其酸甜的口感可以促进人体内肠胃内蛋白质的分解与吸收，开胃健食。辣白菜中含有维生素、胡萝卜素等营养物质，具有延缓衰老和皮肤老化的作用，其含有大量的粗纤维能够促进人体肠胃功能、缓解便秘等功能。辣白菜也含有乳酸菌，其能够抑制有害细菌的繁殖，调节肠胃微生物菌群[35]。

刘长蕾等人[36]研究以朝鲜族辣白菜为原料，在发酵过程中微生物菌群变化。结果显示，明串珠菌是蔬菜发酵初期的主要优势微生物，在辣白菜中发酵20 d 后消失。但乳酸菌是辣白菜和酸菜整个发酵过程中优势菌属。Chang L X 等人[37]以东北地区辣白菜为原料，采用高通量测序分析其微生物菌群多样性，研究微生物菌群与品质相关理化性质及其相关性分析，结果表明优势门为变形菌门（Proteobacteria） 和厚壁菌门（Firmicutes），优势属为乳酸杆菌属、泛菌属、魏氏菌属和假单胞菌属。乳酸杆菌与魏氏菌属与pH 值和盐度呈正相关，与色胺呈负相关，假单胞菌与盐度呈负相关。其中，发酵过程中乳酸菌和芽孢杆菌可以同时消耗葡萄糖等碳水化合物，分解发酵蔬菜产生主要的乳酸和乙酸。另外，根据微生物菌群与品质相关理化指标的相关性，可得出乳酸菌含量的增加会产生大量的乳酸，普氏菌属产生乙酸和琥珀酸，罗斯氏菌属分离出多种糖来生产丁酸，产生的酸进而可促进发酵过程的进行保证产品的品质[38]。杨柳等人[39]研究以朝鲜族辣白菜为原料，在自然发酵过程中菌群结构与主要呈味物质的相关性。结果显示，随着发酵时间的延长，主要呈味物质的含量显著增加。宏基因组学测序技术结果显示在不同发酵阶段微生物菌群结构存在显著差异，并与呈味物质呈正相关。因此，通过对酸度和盐浓度的研究过程，可以更好地分析在发酵过程中微生物菌群在不同发酵时期中发挥的主要作用。

3.3 在东北酸菜生产中的应用

东北酸菜是芥菜通过晾晒后放入杀菌消毒罐中，加入适量食盐、米醋等佐料用鹅卵石压紧密封保存1 个月即可[40]。酸菜中含有大量的膳食纤维，对预防和治疗便秘非常有效。酸菜含有的有益菌可以抑制肠道中致病菌的生长，具有调整肠道菌群、预防肠炎及结肠炎类疾病的作用[41]。

孟繁博等人[42]通过收集11 种芥菜作为酸菜的发酵原料，研究不同品种芥菜对发酵酸菜品质的影响中发现，在发酵第8 天中，全部样品的总酸均超过0.35 g/100 g。“四月青”中维C 的含量最高，“镇江青菜”中还原糖含量最高。孙炜宁[43]应用16Sr DNA高通量测序技术首次在东北酸菜中鉴定出属于肠杆菌的果胶杆菌（Pectobacterium） 和拉恩氏菌（Rahnella）。贾晶晶等人[44]以不同盐浓度的酸菜为原料，通过高通量测序技术对不同盐浓度的样品进行微生物菌群多样性分析。结果发现，样品在门水平上，Proteobacteria（变形菌门） 和Firmicutes（厚壁菌门） 均为优势菌门；在属水平上，Enterobacter（肠杆菌属） 和Lactococcus（乳球菌属） 为优势菌属。周姝静等人[45]以东北酸菜为材料，通过Illumina Novaseq 测序平台进行高通量测序研究东北酸菜发酵前后期细菌多样性及差异性变化。研究显示，样品前后期微生物菌群差异性变化不大，其具有4 种共同的微生物菌属为魏斯氏属（Weissella）、明串珠菌属（Leuconostoc）、乳球菌属（Lactococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus）。在通过宏基因组学测序技术对东北酸菜和辣白菜的共同研究下，发现两者的优势菌门都含有变形菌门（Proteobacteria） 和厚壁菌门（Firmicutes），优势菌属都含有乳酸杆菌、明串珠菌等，进而推测在同一地区的发酵蔬菜过程中会受到相同外界因素的影响随着产生相同主要的发酵菌株。

4 结语

如上所述，近年来宏基因组学技术已应用到发酵蔬菜领域上，并取得了一定的研究成果。由于宏基因组学技术在食品发酵行业的应用上仍存在一些不足，如测序的成本高、数据量庞大，在数据分析过程仍存在困难；测序序列片段短等问题也使发酵行业的发展受到了一定的阻碍。

随着宏基因组学技术的不断发展，目前已有对蔬菜发酵中的四川泡菜、东北酸菜和东北辣白菜中的微生物群落的研究，并从基因层面分析并探讨微生物对蔬菜发酵过程中品质及风味的影响，分析在不同发酵地区中微生物受到不同程度的影响下，发现理化指标和风味物质的测定会影响微生物菌群在整体发酵过程中的作用，不同地区的发酵蔬菜中所含菌属与品质及风味物质之间的相关性分析，从而建立发酵蔬菜腌制过程中关键因素之间的相关性分析模式，为进一步优化蔬菜发酵生产工艺和提升产品质量提供理论支撑，并为蔬菜发酵产业的工业化发展奠定基础。