广西边境地区与非边境地区结核分枝杆菌基因组学分析

叶婧，周崇兴，林玫，先晓敏，梁小烟，张影坤，蓝如束，崔哲哲

1.广西壮族自治区疾病预防控制中心，广西重大传染病防控与生物安全应急响应重点实验室，广西结核病防治重点学科平台，广西 南宁 530028；2.贵州医科大学公共卫生学院；3.广西壮族自治区江滨医院

结核病是一种严重危害人类健康的慢性呼吸道传染疾病，据世界卫生组织估算，2021 年全球新增结核病患者约1060 万例，死亡160 万例[1]，在包括我国在内的大部分国家或地区，结核病仍然是一个重大的公共卫生问题[2-3]。广西地处我国西南部，由于经济相对落后、人群居住密集、医疗资源有限，结核病的发生率处于全国较高水平[4]。同时，因与越南接壤，广西结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）外来谱系输入的风险不容忽视。全基因组测序技术（whole-genome sequencing，WGS）是近年来广泛应用于MTB 分子生物学研究的一项技术[5-6]，为了解广西边境与非边境地区MTB 基因型的分布特征及流行情况，本研究使用WGS 技术对来自广西边境与非边境地区的MTB菌株进行了基因组学分析，现将研究结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 样本来源 选取广西境内东、西、南、北、中5个方位的桂林、贵港、崇左、百色和防城港5 个市作为调查点。其中，与越南接壤的百色、崇左、防城港3 个市作为边境组，未与越南接壤的桂林、贵港2 个市作为非边境组。收集2015—2017 年当地结核病定点医院结核病患者的痰液，采用固体中性罗氏培养基在37℃恒温培养室进行MTB 的分离培养。

1.2 检测方法

1.2.1 DNA 提取 采用CTAB 法提取DNA[7]，在1.5 mL 离心管加入400 μL 1× TE 缓冲液并取满环生长良好的结核分枝杆菌，置于80℃水浴30 min灭活，将灭活后的菌液在细菌超声分散计数仪超声1 min，使细菌充分分散，再加入溶菌酶使细菌充分破壁，然后用SDS/蛋白酶K 混合，用CTAB/NaCl 溶液沉淀非核酸细胞碎片，用氯仿/异戊醇提取DNA，沉淀物经洗涤且自然干燥后，加入50 μL 1×TE 缓冲液使其充分溶解，置-20℃保存备用，作为WGS 检测的DNA 模板。

1.2.2 全基因组测序分析 由北京诺禾致源生物有限公司进行检测，利用高通量二代Illumina 测序技术平台，进行DNA 片段文库构建，双端测序，PE150，深度至少200×，每个样品总测序深度数据量≥1G clean data。测序数据经过过滤处理，去除包含A-dapter 的序列及低质量数据，得到的Clean Da‐ta 用于后续分析。以H37Rv 菌株的全基因组序列（NC000962.2）作为参考模板，使用Samtools 软件进行比对获得每株菌株单核苷酸多态性（single nu‐cleotide polymorphism，SNP）[8]。 将SNP 数 据 与H37Rv 进行比对，获得每株菌株的基因型[9]。采用SAM-TB 平台根据SNP 的数据鉴定MTB 菌株的谱系[10]。将SNP 数据与已报道的结核分枝杆菌耐药基因突变数据库进行比对[11]，获得每株菌株对一线抗结核药品耐药突变基因的类型。

1.3 统计分析 采用SPSS 20.0 统计软件对数据进行整理分析。计数资料采用n（%）表示，组间计数资料差异的比较采用χ2检验、校正χ2检验或Fish‐er 确切概率法，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 MTB 菌株全基因组测序分型结果 共有646株MTB 菌株纳入本次研究。测序结果显示，MTB菌株主要分为4 个谱系，包括Lineage 1（简称L1）、Lineage 2（简称L2）、Lineage 3（简称L3）和Lineage 4（简称L4）。从不同年份看，三年间四种谱系分布差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。边境组测序分析了199 株，结果显示L2（126/199，63.32%）和L4（64/199，32.16%）是主要流行谱系，L1 占4.02%（8/199），L3 仅发现1 株；非边境组测序分析了447株，L2（299/447，66.89%）和L4（144/447，32.21%）是主要流行谱系，L1 占0.89%（4/447），L3 未发现。边境组与非边境组基因型构成分布差异有统计学意义（χ2=9.754，P＜0.05）。见表2。

表1 MTB 菌株谱系时间分布［n（%）］Table 1 Time distribution of MTB strain lineage［n（%）］

表2 广西边境组和非边境组MTB 菌株谱系构成（例）Table 2 The Lineages of 646 MTB strains in border and non border groups in Guangxi（n）

作为最主要的流行谱系，L2 可分为亚谱系L2.1、L2.2 和L2.3，边境和非边境组均以亚谱系L2.3 为主。L2 及其各亚谱系在边境与非边境组的分布差异均无统计学意义（χ2=0.781、0.219、0.419、0.005，P均＞0.05）。L4 在本研究中共发现7 个亚谱系，分别为L4.1.2、L4.2～L4.5、L4.7 和L4.9，边境和非边境组以亚谱系L4.2、L4.4 和L4.5 为主。L4.4 和L4.5 亚谱系在边境和非边境组的分布差异均无统计学意义（χ2=3.779、0.029，P均＞0.05）。L4.2 亚谱系和L1 谱系在边境组与非边境组的分布差异均有统计学意义（χ2=4.833、5.763，P均＜0.05）。见表3。

表3 边境组和非边境组MTB 菌株基因型分布［n（%）］Table 3 Genotype distribution of MTB strains in border and non border groups in Guangxi［n（%）］

2.2 MTB 菌株耐药基因突变类型及分布情况WGS 结果分析，196 株MTB 菌株发生了5 种抗结核药物的相关耐药基因突变，突变率为30.34%（196/646）。其中边境组为40.70%（81/199），非边境组为25.73%（115/447），边境组的耐药基因突变率高于非边境组，差异有统计学意义（χ2=14.613，P＜0.05）。

对196 株菌株分别进行5 种药物的耐药突变基因分析得出，突变率最高的是katG（15.94%，103/646），其 次 分 别 是ropB（11.30%，73/646）、embB（6.04%，39/646）、rpsL（5.88%，38/646）和rrsL（3.72%，24/646）。对突变率前5 的耐药相关基因的分布分析发现，katG、ropB、rpsL 基因在边境组的突变率均高于非边境组，差异均有统计学意义（χ2=5.716、9.603、6.979，P均＜0.05）。见表4。对突变率前5 的耐药相关基因位点的分布分析发现，katG315、rpoB450、rpsL43 基因位点在边境组与非边境组的分 布 差 异 均 有 统 计 学 意 义（χ2=5.153、12.893、11.693，P均＜0.05）。见表5。

表4 MTB 分离株耐药基因突变在广西边境与非边境地区的分布［n（%）］Table 4 Distribution of drug resistance gene mutations in MTB isolates in border and non-border areas in Guangxi［n（%）］

表5 MTB 分离株耐药基因突变位点在广西边境与非边境地区的分布Table 5 Distribution of drug resistance gene point-mutations in MTB isolates in border and non-border areas in Guangxi

3 讨 论

基于WGS 的单个核酸多态性（SNP）是MTB常用的基因分型方法，该方法具有通量大、分辨率高、可进行精准分型和鉴定、能够构建完整的DNA序列等优点[12]，既往研究表明，其与McSpoligotyp‐ing 分型方法的一致性可达94.18%[7]。目前，WGS在MTB 分离株基因分型方面具有许多优势，并且可以有效地研究MTB 分离株的传播动力学，可鉴定出与MTB 耐药相关的基因突变[13]。

研究表明[14-15]，MTB 基因分型可以分为7 个主要谱系（Lineage 1～7，简称L1～L7），本研究发现广西主要流行谱系为L2 和L4，这与我国总体情况基本一致[16]。广西的边境和非边境地区的L2 谱系均以亚谱系L2.3 为主，L4 谱系均以亚谱系L4.2、L4.4 和L4.5 为主。既往研究认为，L4.5 亚谱系主要存在于中国，且可能由广东向西南传播[17-18]，本次研究结果一定程度上佐证了上述观点。L1 和L3 谱系主要流行于东非、中亚、南亚及东南亚等地[19-20]，但在我国较为少见，本研究在广西边境和非边境地区均发现L1 谱系，且在边境地区发现1 例L3 谱系，推测可能是从东南亚地区经边境传入，并有继续向非边境地区传播的可能。

既往研究表明，广西的结核病耐药负担较重[21]。MTB 耐药的主要机制是基因突变，广西边境地区耐药基因突变率高于非边境地区，与越南河内的突变率较为接近[22]，可能因为边境地区人口构成较为复杂，人口流动较大且与邻国经济文化交流较为频繁。

既往研究中，与异烟肼（isoniazid，INH）耐药相关的基因主要有katG 和inhA[23]。本研究中，在耐INH 基因突变菌株中共检测4 种基因发生突变，分别为katG、fabG1、ahpC 和inhA，INH 的耐药基因突变率在主要抗痨药物中最高（19.20%），与青海省和杭州市的报道基本一致[24-25]。4 种基因突变中以katG 基因突变为主，主要突变位点为katG315，与Sunil 等[26]研究一致；此外哈萨克斯坦、伊朗和我国北京市[27-29]的研究数据也都提示katG315 位点突变比例高。该现象可能与INH 作为全效抗结核药物被广泛用于结核治疗有关[30]，当患者不规律用药，治疗依从性差时，便容易产生INH 的耐药，应当引起重视。

利福平（rifampin，RIF）是重要的一线抗结核药物，用于治疗结核已超过50 年[31]。本研究发现MTB 分离株耐RIF 基因突变（11.30%）仅次于耐INH。利福平耐药主要是rpoB 基因突变导致，本研究中广西rpoB 基因突变位点以rpoB450 和rpoB445 为主，与曾美春等[32]报道的浙江rpoB 最常见的突变位点是rpoB450 较为一致。我国不同地区rpoB 基因突变位点呈多样化，但本研究中400、427、430、431、432、435、437 和452 等突变位点均有发现，可能与研究的地区及民族的差异性有关，侧面说明耐药基因突变特征在不同民族中可能存在差异。

本研究发现，边境组katG、ropB 和rpsL 基因的突变率高于非边境组，可能与边境地区结核病控制水平、结核病治疗人群的相关求医行为以及当地菌株的遗传背景等有关，具体原因尚待进一步研究。

不同国家、不同省份、甚至同个省份不同城市的结核病耐药率及耐药基因突变谱都可能不同。目前我国仍然缺乏对这些耐药基因突变位点分布的总体描述。本研究在基因组学的水平上分析了主要的耐药相关基因突变位点和频率，给全国耐药相关基因突变的分布提供了一部分依据。在今后的工作中，应加强结核病的耐药筛查，尽早发现耐药结核病患者，通过指导临床规范治疗、加强管理，降低耐药结核病的传播风险。

利益冲突声明全部作者声明无利益冲突

作者贡献声明叶婧、周崇兴、崔哲哲负责撰写和修改论文；林玫负责设计研究思路；蓝如束、梁小烟、先晓敏、张影坤负责研究数据的获取和分析