紫背万年青提取物联合吉非替尼对A549肺癌细胞的协同作用研究*

廖锦彬，张 倩，周妙姿，李楚文，周 莹，张建军

（1.广东省第二中医院（广东省中医药工程技术研究院），广东 广州 510095；2.广州医科大学，广东 广州 511436；3.广州中医药大学，广东 广州 510006）

肺癌是最常见的恶性肿瘤，非小细胞肺癌（nonsmall cell lung carcinoma, NSCLC）在肺癌中占比最大，其病死率也常居癌症死因的首位[1]。当前，化疗方案仍是肺癌治疗的主要措施。吉非替尼（Gefi‐tinib,GEF）是经典的表皮生长因子受体酪氨酸激酶（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase,EGFR-TKI）抑制剂，临床对NSCLC 肺癌患者具有显著效果[2]。但由于EGFR 突变和肿瘤干细胞增多等原因，GEF 治疗后往往出现肿瘤耐药（multiple drug resistance, MDR），导致患者的预后和生存较差。因此，寻找高效安全的药物用于EGFR-TKI辅助治疗和克服耐药性，目前临床肺癌治疗的迫切需要。

紫背万年青（Rhoeo discolor（L’Herit.）Hance）属于鸭跖草科植物，《全国中草药汇编》记载，其以花叶入药，具有清热化痰，凉血止痢的功效；用于肺燥咳嗽，咯血，百日咳，淋巴结结核，痢疾，便血[3]。已有研究报道，紫背万年青对于结肠癌、肝癌、前列腺癌的细胞增殖均有抑制作用，能减少癌前病灶数量和面积，拮抗二乙基亚硝胺对肝细胞的损害[4-6]。基于紫背万年青对于多种癌细胞的抑制作用，及其临床实践基础，本研究拟探讨紫背万年青提取物（Water ex‐tract from Rhoeo discolor,WER）与GEF 联用对A549肺癌细胞的协同作用，并阐明其可能的分子机制，为紫背万年青作为肺癌治疗的辅助药物或化疗增敏剂提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株 人肺癌A549 细胞广州吉妮欧生物科技有限公司。

1.2 药物与试剂 紫背万年青花水提液由广东省第二中医院制备（浓度：0.75g/ml 的生药量，批次：202012001#）。DMEM 培 养 基（11965118）、RPMI-1640 培 养基（11875119）、胎牛 血 清（10100147）、0.25% 胰蛋白酶（25200056）、青霉素和链霉素（15140122）等购自Gibco 公司（美国）；吉非替尼（SML1657）购自Sigma 公司（美国）；抗体Bcl-2（4223）、Bax（2772）、p-PI3K（4228）、p-Akt（4060）和GAPDH（5174）等购 自CST 公司（美 国）；CCK-8（C0041）、Annexin V-FITC 细 胞凋 亡 检测 试 剂盒（C1062S）、细胞周期检测试剂盒（C1052）和PBS 购自上海碧云天公司（中国）；超敏ECL 化学发光试剂盒（G2020）购自武汉塞维尔生物科技（中国）。

1.3 仪器 5424R 型高速离心机（德国Eppendorf 公司）；OptiMair 型超净工作台（新加坡Esco 公司）；DM2500 型荧光倒置显微镜（德国Leica 公司）；MPR-440F 型低温冰箱（日本Panasonic 公司）；Epoch 型全波长酶标仪（美国BioTek 公司）；Forma 310 系列CO2恒温培养箱（美国Thermo 公司）；AI 800 型超灵敏多功能成像仪（美国GE 公司）；BD Accuri C6 流式细胞仪（美国BD公司）。

1.4 细胞培养A549 细胞培养在含1%链霉素-青霉素和10%胎牛血清的RMPI-1640 培养基中。A549细胞在37 ℃，5%CO2恒温培养箱中培养。实验取对数生长期细胞进行测试。

1.5 细胞活力检测 取对数生长期的A549 细胞消化制成悬浮液，用RMPI-1640 培养基配制成8×104个/mL 的细胞混悬液，每孔按100 μL 接种于96 孔板，细胞贴壁24h 后，将培养基吸出，按需加入含有WER、GEF、WER+GEF 联用药物。实验分别以PBS 作为空白溶剂对照。细胞孵育48h 后，采用CCK8 试剂盒检测细胞活力。酶标仪测定450 nm 波长条件下吸光值（OD 值），并计算对细胞增值的抑制率（%）=1-（药物OD值/空白对照OD值）×100和药物的IC50。

1.6 Isobologram 法分析药物相互作用 参照文献方案[7]，依据CCK-8 的实验结果，得出不同浓度WER、GEF 对A549 细胞的IC50，分别设为WIC50和GIC50，在横纵坐标轴上绘制a 点（WIC50，0）和b 点（0，GIC50），连接a、b 两点的直线作为相加线。根据CCK-8 实验结果，求得不同浓度GEF 与WER（2.5mg/mL）联用的GWIC50，绘制点c点（2.5，GWIC50）。若点c 在a b 连线下方，则表示两药联用存在协同作用；若在连线上方，则表示两药联用存在拮抗作用。

1.7 细胞凋亡检测 取对数生长期的A549 细胞消化制成悬浮液，用RMPI-1640 培养基配制成1×106个/mL 的细胞混悬液，每孔按2 mL 接种于6 孔板，细胞贴壁24h 后，将培养基吸出，按需加入含有WER、GEF、WER+GEF 联用的培养基。实验分别以PBS 作为空白溶剂对照。细胞孵育48h 后，根据试剂盒说明，胰酶消化并收集细胞，分别加入Binding 溶液，AnnexinV-FITC 和PI 溶液，避光反应20 min，PBS 清洗，流式细胞仪检测。

1.8 细胞周期检测 如上2.4，药物处理48h后，消化收集细胞，PBS 清洗、离心、重悬，加入预冷乙醇，4℃固定12h。然后，PBS清洗、离心、重悬细胞，按照试剂盒说明书，加入PI染液避光反应20 min，PBS清洗，流式细胞仪检测。

1.9 Western blot 检测相关蛋白 如上2.4，药物处理48h 后，PBS 清洗细胞，加入细胞裂解液，收集细胞裂解液，冰上裂解30 min，高速离心20 min。收集上层清液，蛋白定量并调整蛋白浓度，加上样缓冲液，并于100 ℃金属浴变性10 min。蛋白样品采用12%SDSPAGE 凝胶电泳，转至PVDF 膜。室温封闭1 h。随后，加入相应一抗（按1：1000 稀释），4℃孵育12h，TBST 清洗后加入二抗（按1：2000 稀释），室温下孵育2 h，TBST清洗后采用凝胶成像系统和ECL检测试剂检测分析蛋白表达。

1.10 数据分析 采用GraphPad Prism 8.0 统计软件进行数据处理和绘图，数据以mean±SEM 表示，采用One-way ANOVA 进行数据分析，P＜0.05 认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 WER 与GEF 联用协同抑制A549 细胞的细胞活力和细胞增殖 如图1（A）所示，CCK-8 实验结果表明，处理48h 以后，WER 在浓度低于2.5 mg/mL 时，A549 细胞的增殖仍保持在约90%以上；浓度提高到5～80 mg/mL 时，WER 呈现抑制A549 细胞增殖的作用，且具有浓度依赖性，差异具有统计学意义（P＜0.05）。计算得到，WER 抑制作用的IC50 值为14.98mg/mL。因此，我们选择无明显细胞毒性的2.5mg/mL 与不同浓度的GEF（1.25～40 μmol/L）联用使用。如图1（B）所示，给药后，GEF 对A549 细胞的抑制IC50从13.36 μmol·L-1降低到7.48 μmol/L；其中，与GEF 单用比较，10.0 和20.00 μmol/L 剂量的GEF 与2.5 mg/mL WER 联用后，A549 细胞的增殖率显著降低，其差异均具有统计学意义（P＜0.05）。同时，如图1（C）所示，Isobologram 分析结果提示，GEF 与2.5 mg/m WER 联用对A549 细胞的IC50坐标c（2.5，7.48）落在a 点（WIC50，0）和b 点（0，GIC50）连线的下方，提示，GEF 与2.5 mg/mL WER 联用后，对A549 细胞产生协同作用。因此，选择低浓度、低毒性的7.5 μmol/L 的GEF与2.5 mg/mL 的WER联用进行后续实验研究。

图1.WER与GEF联用对A549细胞的细胞增殖和细胞活力的作用Fig.1 Effects of WER and GEF on cell viability and proliferation of A549 cells

2.2 WER 与GEF 联用协同诱导A549 细胞的细胞凋亡 如图2（A）所示，流式检测结果发现，药物处理后，对照、WER、GEF 和WER+GEF 组的A549 细胞凋亡率 分 别 为（6.55±0.92）% 、（9.49±1.18）% 、（21.36±2.37）%和（32.13±4.06）% ；与GEF 单 用 组 对 比，WER+GEF 联用组，细胞凋亡率显著升高，其差异有统计学意义（P＜0.05）。随后，如图2（B 和C）所示，Western blot 检测结果也发现，药物处理后，与GEF单用组对比，WER+GEF 联用组的Bax/Bcl-2 蛋白表达比例显著上调，其差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2.WER与GEF 联用对A549细胞的细胞凋亡的作用Fig.2 Effects of WER and GEF on apoptosis of A549 cells

图3.WER与GEF 联用对A549细胞的细胞周期的作用Fig.2 Effects of WER and GEF on cell cycle of A549 cells

2.3 WER 与GEF 联用协同阻滞A549 细胞的细胞周期 如图3 所示，流式检测结果发现，药物处理后，对照、WER、GEF 和WER+GEF 组的A549 细胞的G0/G1 期DNA 含量百分比平均值分别为29.51%、33.81%、44.28% 和61.57%。与GEF 单 用 对 比，WER+GEF联用组的G0/G1期细胞比例明显升高，细胞分裂周期停滞在G0/G1 期的能力更强，其差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 WER 与GEF 联用协同 降低p-PI3K 和p-AKT 的蛋白水平 如图4 所示，Western blot 检测结果发现，药物处理后，与GEF 单用对比，WER+GEF 联用组细胞中PI3K/Akt 信号通路相关蛋白p-PI3K 和p-Akt的相对表达水平显著降低，其差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图4.WER与GEF 联用对A549细胞的p-PI3K和p-AKT蛋白表达的作用Fig.2 Effects of WER and GEF on protein level of p-PI3 and p-AKT of A549 cells

3 讨论

吉非替尼是第一代EGFR-TKIs，在治疗具有激活EGFR 突变的NSCLC 患者中疗效显著，可改善无进展生存期，但是GEF对野生型EGFR和KRAS突变患者不敏感，且大部分患者在接受GEF 治疗一年左右会出现获得性耐药[8]。根据现代医学对肺癌病理和临床表现的认识，可将肺癌归属于“肺积”、“息贲”、“劳嗽”等中医疾病范畴。《素问.咳论》中记载肺咳之状，咳而喘息有音，甚则唾血”，肺所导致的咳之症状，具有咳而气喘，呼吸有声，甚至伴有唾血等特点，这与现代医学中常见的肺癌临床表现相似[9]。目前，国内对于紫背万年青药效的研究较少，仅见罗利琼等[10]研究了其内生真菌类群的分布及抗菌、抗肿瘤活性，发现其内生真菌的发酵液有抗菌作用，并对肝癌细胞和乳腺癌细胞有抑制作用。国外的相关研究主要集中在墨西哥，Arriaga-Alba 等报道紫背万年青醇提物具有抗氧化、抗诱变和抗基因毒性的作用，不具有致突变或基因毒性，其抗致突变性的机制可能为烷基化，修正ogt基因编码的烷基鸟嘌呤转移蛋白酶[4]。Rosales-Reyes等[5]研究表明紫背万年青的水提物对肝癌大鼠有良好的保护作用，且药物对肝脏没有损害作用。García-Varela 报道[11]紫背万年青具有抗微生物和抗真菌作用，其水、甲醇、乙醇提取物对结肠癌、肝癌、前列腺癌的细胞增殖均有抑制作用[6]，能减少癌前病灶数量和面积[5]，拮抗二乙基亚硝胺对肝细胞的损害。紫背万年青提取物具有清热化痰，凉血止痢的功效，用于肺燥咳嗽，咯血，百日咳，淋巴结结核[3]，这与现代医学中常见的肺癌临床表现相似。因此，研究紫背万年青提取物与吉非替尼联用对A549 肺癌细胞的协同抑制作用，并阐明其可能的分子作用机制，对于克服吉非替尼耐药或者增加其对癌细胞的敏感性都具有重要的意义。

本研究通过CCK-8 实验，发现紫背万年青提取物WER（剂量大于10 mg/kg）和吉非替尼GEF（剂量大于5μmol/L）可以显著抑制A549 细胞的细胞增殖和细胞活力，且呈剂量依赖性。低剂量的WER 或GEF 单独给药时对A549 细胞的增殖和活力抑制作用不明显；但是WER 和GEF 两药联用后则抑制效果显著，通过Isobologram 分析也进一步明确低剂量WER 和GEF 联用对A549 细胞的增殖和活力具有协同抑制作用。流式检测结果发现，WER 和GEF 联用可以促进A549 细胞的细胞凋亡。进一步的蛋白表达检测提示，WER 和GEF 联用可以干预凋亡调控蛋白Bcl-2 家族的表达水平；WER 和GEF 联用促进促凋亡蛋白Bax 的表达，降低抑制凋亡蛋白Bcl-2 的表达，提示两药联用后促进A549 的细胞凋。同时，流式检测结果也发现WER+GEF 联用组的G0/G1 期细胞比例明显升高，细胞分裂周期停滞在G0/G1 期的能力更强。因此，WER+GEF 联合用药后，对细胞增殖、细胞凋亡和细胞G0/G1期阻滞，起到协同作用。

PI3K/Akt 信号通路体系是细胞生存和发育的重要通路。已有研究证实，激活PI3K/Akt 通路是肿瘤耐药性形成的因素之一[7]。肺癌的多种生长因子主要通过PI3K/Akt 信号转导通路发挥作用，肿瘤细胞经化疗药物作用后增加了Akt 磷酸化水平，并激活PI3K/Akt 信号通路，活化的Akt 进一步激活其下游因子使癌细胞对化疗药物产生耐药性[7,12]。本研究结果表明，WER+GEF 联用后可以显著降低PI3K 和Akt 蛋白的磷酸化水平；结果提示，两药联用可协同抑制PI3K/Akt 通路的激活，从而增强药物对细胞的作用。

综上所述，WER 和GEF 联合用药后起到协同作用，显著抑制细胞增殖，促进细胞凋亡和增加细胞G0/G1期阻滞，其可能的机制与PI3K/Akt信号通路的抑制作用密切相关。本研究为紫背万年青作为肺癌治疗的辅助药物或化疗增敏剂的提供新的研究资料。