鳄蜥源葡萄牙柠檬酸杆菌和摩氏摩根菌的分离鉴定及药敏分析

吕美，郭怡德，陈耀还，罗文贤，曾晓晨，江海英，陈金平，靖元孝

（1.华南师范大学生命科学学院，广州，510631；2.广东省科学院动物研究所，广东省动物保护与资源利用重点实验室，广州，510260；3.广西大桂山鳄蜥国家级自然保护区管理中心，贺州，542800）

鳄蜥（Shinisaurus crocodilurus）隶属于爬行纲（Reptilia），有鳞目（Squamata），鳄蜥科（Shinisauri⁃dae），鳄蜥属（Shinisaurus），是国家一级重点保护野生动物，世界自然保护联盟（IUCN）濒危（EN）物种［1］，CITES 附录Ⅰ物种［2］，主要分布在我国广东、广西和越南东北部广宁省安图自然保护区［3］。为了促进鳄蜥种群数量复壮，人工救护繁育成为保护鳄蜥的重要措施，并取得了较好的效果［4］。但有研究表明，由于环境的限制，人工繁育的鳄蜥常会受到一些疾病的侵袭，导致鳄蜥死亡［5］，这些疾病主要包括因感染龟嗜皮菌（Austwickia chelonae）造成的皮肤肉芽肿病［6］，感染铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）造成的皮肤溃疡病［7］等。

柠檬酸杆菌属（Citrobacter）和摩氏摩根菌属（Morganella）细菌广泛存在于水、土壤等自然环境以及动物的肠道中，为常见的条件致病菌和人兽共患病原菌，易造成动物腹泻、继发感染等疾病。近年来，已有许多关于柠檬酸杆菌属感染动物的报道，如弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）可引起加州鲈（Micropterus salmoides）［8］、牛 蛙（Rana catesbeiana）［9］和巴西龟（Trachemys scripta elegans）［10］等水生动物体表局部充血、出血和溃烂等症状。布氏柠檬酸杆菌（Citrobacter braakii）可引起菌血症［11］。葡萄牙柠檬酸杆菌（C.portucalensis）可导致星点水龟（Clem⁃mys guttata）精神状态差、食欲减退和眼睛炎症等［12］。摩氏摩根菌（Morganella morganii）可感染水生动物，主要症状表现为患病动物食欲不振、甚至废绝，精神状态差，体表皮肤溃烂和出血等，如黄喉拟水龟（Mauremys mutica）感染该菌后会行动迟缓、食欲废绝、爪脱落和头肢部溃烂等［13］，中国大鲵 （Andrias davidianus）感染后表现为拒食、行动迟缓和体表有出血点等［14］，胡子鲶（Clarias fuscus）感染后表现为体表有大量黏液、腹部肿大和肛门红肿等［15］。

2021 年7 月，在广西大桂山鳄蜥国家级自然保护区北娄管理站发现一些鳄蜥发生严重感染并有零星死亡。通过形态学观察、生理生化试验、分子生物学方法和药敏试验，并结合多位点序列分型（multilo⁃cus sequence typing，MLST）方法探究鳄蜥感染的病原，旨在为鳄蜥细菌性疾病的预防控制提供理论依据。

1 试验材料

广西大桂山鳄蜥国家级自然保护区北娄管理站救护繁育的鳄蜥于2021年7月发生细菌性感染疾病，导致零星死亡。鳄蜥生前的临床表现为四肢无力，行动迟缓、甚至停滞，精神萎靡，反应迟钝，食欲不振。

2 试验方法

2.1 病原菌分离与培养

将鳄蜥尸体无菌解剖，取肺和肝组织划线接种于胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）上，倒置在恒温生化培养箱中30 ℃培养18～24 h 后，挑选形状一致的优势菌落纯化，直至获得形态大小一致的纯菌落。挑取纯菌在胰酪大豆胨液体培养基（TSB）中28 ℃培养12～16 h，加终浓度为20%的甘油，置于冰箱中−80 ℃保存备用。

2.2 病原菌鉴定

2.2.1 形态和生理生化鉴定

将在超低温冰箱中保存的菌株活化后，划线接种于营养琼脂培养基上，30 ℃培养24 h后，观察菌落的形状、边缘、隆起形状和透明度等表型特征。

对分离纯化后的菌株分别进行革兰氏染色和镜检。取菌株分别接种于肠杆菌科细菌生化鉴定管（购自杭州微生物试剂有限公司）中，按照说明书操作，并对结果进行初步判定。

2.2.2 分子生物学鉴定

使用16SrRNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）进行PCR 扩增，PCR 反应体系为25.0 μL：正、反引物各1.0 μL，PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，模板1.0 μL。反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，34 个循环；72 ℃终延伸10 min，4 ℃保温。同时，使用无菌水作为阴性对照，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，将测序后分离菌株的16S rRNA 基因序列通过BLAST 程序比对，并通过MEGA 11.0.11 软件对序列进行分析及构建进化树。根据形态学和分子生物学鉴定结果，初步判定感染鳄蜥的是柠檬酸杆菌属和摩氏摩根菌属细菌，因此依据这2 个菌属开展后续研究。

recN基因（编码DNA 修复蛋白）作为柠檬酸杆菌属的特异标志之一，可以用来准确区分和鉴定柠檬酸杆菌属的各个菌种［16］。在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下载柠檬酸杆菌属的14种recN基因序列，经比对后，设计引物recN-F（5′-ATTGCVATTGATGCKCTCGG-3′ ），recN-R（5′-AAATCCAGACGATCGCAATA-3′）对分离菌株进行recN基因的PCR 扩增和鉴定。PCR 扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，通过MEGA 11.0.11软件对序列进行分析及构建进化树。

使用HiPure Stool DNA Mini Kit 粪便DNA小提试剂盒（上海迈跟生物科技有限公司）提取鳄蜥 肠道内容物的DNA，选取摩氏摩根菌特异性引物Mm208F（5′-CTCGCACCATCAGATGAACCCATAT-3′），Mm1017R（5′-CAAAGCATCTCTGCTAAGTTCTCTGGATG-3′）［17］以及柠檬酸杆菌属特异引物recN-F和recN-R 对鳄蜥的肠道内容物进行PCR 扩增，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR 扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

2.3 药敏试验

采用纸片扩散（K-B）法对分离菌株进行12种抗菌药物敏感性试验，依据美国临床实验室标准机构（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）药敏试验执行标准［18］判定菌株对抗生素的敏感性。

2.4 多位点序列分型（MLST）

为探究分离菌株的变异情况，按照柠檬酸杆菌属多位点序列分型方案（https：//pubmlst.org/organ⁃isms/citrobacter-spp），参考Bai等［19］的研究方法，扩增7 个管家基因（aspC、clpX、fadD、mdh、arcA、dnaG和lysP）后，由生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

将分离菌株的7 个管家基因序列分别上传至柠檬酸杆菌属多位点序列分型数据库，并与标准菌株比对，分析各等位基因位点的变化情况，形成等位基因谱。选取同源性较高的序列拼接后使用MEGA 11.0.11 软件中的neighbor-joining（NJ）法构建系统进化树。

3 结果

3.1 形态学观察

鳄蜥尸体解剖后见肺充血、肿大，肝肿大，肠壁变薄，肠内胀气、肿大，腹部含有腹水（图1）。

图1 鳄蜥剖检结果Fig.1 Results of necropsy of Shinisaurus crocodilurus

3.2 菌株分离培养与鉴定

从鳄蜥尸体的肺和肝中各分离得到1 株细菌，分别命名为BL1682F 和BL1682G。两个分离菌株在普通营养琼脂培养基中生长状态良好。BL1682F 呈圆形，中间隆起、表面光滑、半透明、边缘整齐；BL1682G 呈圆形、中间凸起、表面光滑、湿润。革兰氏染色结果均为阴性，杆状（图2）。

图2 分离菌株的革兰氏染色形态Fig.2 Gram staining morphology of isolated strains

分离菌株的氧化酶试验均为阴性，生化鉴定结果见表1，查阅产品编码检索表，参考《简明第八版伯杰细菌鉴定手册》［20］，初步判断BL1682F为柠檬酸杆菌属细菌，BL1682G为摩氏摩根菌属细菌。

表1 分离菌株的生理生化特性Tab.1 Physiological and biochemical properties of isolated strains

3.3 分离菌株的分子生物学鉴定

BL1682F的16S rRNA基因序列与GenBank数据库中葡萄牙柠檬酸杆菌P10159（CP012554）和弗氏柠檬酸杆菌EnZ-4（MN220573）的一致性均为100.00%，与杨氏柠檬酸杆菌（Citrobacter youngae）L6（CP021963）和布氏柠檬酸杆菌PS 70（KP969055）的一致性均为99.93%；BL1682G 的16S rRNA 基因序列与摩氏摩根菌DG56-16（CP032295）的一致性为99.86%（图3）。结合16S rRNA 系统进化分析进一步判定BL1682F 为柠檬酸杆菌属，BL1682G 为摩氏摩根菌属。

图3 基于16S rRNA基因序列的NJ系统发育进化树Fig.3 Neighbor-joining（NJ）tree based on 16S rRNA gene sequences

为进一步确定BL1682F 在柠檬酸杆菌属中的分类，将BL1682F的recN基因序列与柠檬酸杆菌属其他的recN基因序列进行比较（表2），发现该菌与葡萄牙柠檬酸杆菌之间的相似性最高，为99.6%，其次是弗氏柠檬酸杆菌，为93.0%。利用recN基因序列构建系统进化树（图4），发现BL1682F 与葡萄牙柠檬酸杆菌最接近，这与表2 的结果类似。以上结果说明，分离得到的BL1682F 为葡萄牙柠檬酸杆菌。

表2 柠檬酸杆菌属不同细菌菌种中的recN相似性比较Tab.2 The comparison of recN gene similarity in different species of bacteria of the genus Citrobacter spp.

图4 基于recN基因序列的NJ系统发育进化树Fig.4 Neighbor-joining（NJ）tree based on recN gene sequences

肠道内容物PCR 扩增后的电泳结果表明，2种细菌的条带大小正确，与阳性样本一致（图5），结果证实了死亡鳄蜥肠道内容物中也存在葡萄牙柠檬酸杆菌和摩氏摩根菌。

图5 患病鳄蜥肠道内容物中摩氏摩根菌和葡萄牙柠檬酸杆菌的检测结果Fig.5 Detection of Morganella morganii and Citrobacter portucalensis in the intestinal contents of Shinisaurus crocodilurus

3.4 分离菌株的药敏分析

依据CLSI 药敏试验标准鉴定手册［18］，对2 个分离菌株进行药敏试验。结果表明：分离菌株BL1682F 对庆大霉素、阿米卡星、头孢呋辛、头孢吡肟、环丙沙星、磺胺甲唑、氨曲南和四环素敏感，对氨苄西林耐药；分离菌株BL1682G对庆大霉素、哌拉西林、头孢曲松、头孢吡肟、磺胺甲唑和氨曲南敏感，对头孢呋辛和四环素耐药（表3）。

表3 分离菌株的药敏试验结果Tab.3 Results of drug sensitivity tests of isolated strains

3.5 分离菌株BL1682F 的MLST 分型结果及系统发育分析

将分离菌株BL1682F 的7 个管家基因序列上传至柠檬酸杆菌多位点序列分型数据库中进行比对分析，结果显示分离菌株未完全匹配数据库中的标准菌株。根据比对结果，选取同源性较高的11 株柠檬酸杆菌构建系统进化树，与BL1682F 亲缘关系最近的是ST-4 和ST-267，其次是ST-260（图6），均有3个等位基因数值匹配，而BL1682F 与其他8 株ST 型仅有2个等位基因数值匹配（表4）。

表4 BL1682F与标准菌株的多位点序列分型Tab.4 Multi-site sequence typing of BL1682F and standard strains

图6 BL1682F与标准柠檬酸杆菌菌株序列的系统进化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of sequences of BL1682F and Citrobacter strains

4 讨论

在细菌基因组中，16S rRNA 基因普遍存在，其功能稳定，且高度保守，不易发生水平基因转移，已成为细菌分类鉴定的重要分子标记［21］。毛烁君等［22］在患病中华鳖（Pelodiscus sinensis）的肝和腹水中分离到1 株细菌，经16S rRNA 测序鉴定为弗氏柠檬酸杆菌。杨星等［23］通过16S rRNA 基因测序，在患病濒死大鲵肝中分离到1 株细菌，最终鉴定为类志贺邻单胞菌（Plesiomonas shigelloides）。本研究中，从死亡鳄蜥肝中分离得到的菌株BL1682G，经16S rRNA 测序鉴定为摩氏摩根菌。然而，16S rRNA 测序方法在区分多态性和相似性较高的菌种时具有一定的局限性。柠檬酸杆菌属细菌的16S rRNA 基因序列具有很强的多态性，因此仅用16S rRNA 基因来鉴定柠檬酸杆菌属具体菌种的目标是不准确的。在本研究中，使用16S rRNA 对鳄蜥肺中分离的BL1682F 菌株扩增，经BLAST比对，发现与GenBank数据库中柠檬酸杆菌属中的弗氏柠檬酸杆菌、布氏柠檬酸杆菌和葡萄牙柠檬酸杆菌等均具有很高的相似性。有研究表明，柠檬酸杆菌属的各个菌种可由recN基因准确区分［16］。因此，本研究采用16S rRNA和recN基因来共同鉴定分离菌株，结果表明，从鳄蜥肺中分离的BL1682F菌株为葡萄牙柠檬酸杆菌。

为了确定有效的抗生素，对鳄蜥肺中分离的葡萄牙柠檬酸杆菌进行药物敏感性测试，结果显示葡萄牙柠檬酸杆菌对庆大霉素、阿米卡星、头孢呋辛、头孢吡肟、环丙沙星、磺胺甲唑、氨曲南和四环素敏感，对氨苄西林耐药。而在星点水龟体内分离出的葡萄牙柠檬酸杆菌具有广泛的耐药型，其对庆大霉素、四环素、多西环素、卡那霉素、链霉素、妥布霉素、新生霉素、红霉素和青霉素表现出耐药，对新霉素表现为敏感［12］。此外，鳄蜥肝中分离的摩氏摩根菌对庆大霉素、哌拉西林、头孢曲松、头孢吡肟、磺胺甲唑和氨曲南敏感，对头孢呋辛和四环素耐药。李瑞伟等［14］研究发现，从患病大鲵肝中分离到的摩氏摩根菌对哌拉西林、头孢曲松、头孢吡肟、氨曲南和四环素敏感，对头孢呋辛和氨苄西林耐药。尹梦雅［24］从患病中华鳖体内分离到的摩氏摩根菌对头孢曲松敏感，对庆大霉素、四环素、亚胺培南、环丙沙星和氨苄西林耐药。以上结果表明，对于同一种细菌，不同来源菌株的药物敏感性结果产生的差异，可能与环境因素和菌株本身有关。从鳄蜥肺和肝中分别分离的葡萄牙柠檬酸杆菌和摩氏摩根菌对抗生素不存在较强的耐药性，表明鳄蜥目前的生存环境受抗生素污染的可能性较小。

多位点序列分型是一种基于比较分离菌株与数据库中标准菌株管家基因的核酸序列来测定分离菌株基因型的方法，该方法已广泛用于细菌的分子流行病学研究［25］。本研究结果表明，从鳄蜥肺中分离的葡萄牙柠檬酸杆菌BL1682F 为新的序列型（ST），管家基因发生了变异，此管家基因序列与MLST 数据库中不存在相应的等位基因编号。因此，证明BL1682F 为新型菌株，目前无法从现有数据库中找到其流行病学规律。为了深入探究葡萄牙柠檬酸杆菌的遗传进化规律和跨物种间的致病机理，后续研究应对不同来源动物的葡萄牙柠檬酸杆菌进行耐药及毒力等相关特殊基因型汇总分析。