滤膜过滤法在大熊猫尿液采集及代谢组学中的应用

闫拯，夏雪宜，杨嫡，徐海泓，崔胜楠，耿珠峰，何清，刘学锋，刘彦晖，杨伊，刘皓秋，张成林，刘定震

（1.北京师范大学生命科学学院，生物多样性与生态工程教育部重点实验室，北京，100875；2.圈养野生动物技术北京市重点实验室，北京，100044；3.北京动物园管理处，北京，100044；4.北京师范大学分析测试中心，北京，100875；5.天津大学化工学院，天津，300072）

代谢组学技术被广泛应用于人类和动物的疾病与健康状况评估［1−3］。尿液代谢物水平分析可用于监测动物的健康状况、妊娠诊断、发情状态和应激水平。动物的尿液相比于其他生物样品，具有代谢物种类含量多、组成物质相对简单且蛋白含量低等优势，是监测其生理、发情状态和福利状况优劣的常用样本［4−5］。然而，因安全考虑以及在动物排泄的同时采集尿液的困难，目前研究人员多选择动物离开或被转移后采集遗留在圈舍地面的样品，或者通过在动物圈舍铺垫塑料布的方式收集尿液样品［6−7］。采用这些方式获得的尿液样品都会因为沾染了土壤和动物的粪便等污染源，导致样品的污染从而影响代谢组学的检测结果［8］。叠氮钠（叠氮化钠，NaN3）作为防腐剂能够有效抑制细菌代谢繁殖，曾被作为代谢组学用尿液样品预处理的首选化合物［9］，叠氮钠处理后的尿液中代谢物更加稳定［10−11］。但叠氮钠属爆炸性、剧毒性的化学物质，不便携带和保存［12］，因此亟需找到一种替代方案收集并处理动物的尿液样品用于代谢组学分析。

大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）作为生物多样性保育的一个旗舰物种兼明星物种，深受全世界人民的喜爱，有关其迁地保护状况以及福利情况也备受瞩目，因此是开展本研究工作的一个理想研究对象。大熊猫尿液样本中含有睾酮、雌二醇、孕酮和皮质醇等丰富的化学物质和代谢物质，已被广泛应用于大熊猫的各项生理研究［13−14］，Zhu等［2］通过核磁共振氢谱（1H NMR）技术对健康大熊猫的粪便、尿液、血清和唾液进行代谢组学分析，共鉴定出107种代谢物。此外，大熊猫血清和尿液代谢物成分及其相对含量还受年龄和性别的影响［15−16］。然而，通过对尿液样品的不同处理并借助微生物培养法和代谢组学分析比较法探讨代谢组学用尿液样品预处理方法研究，迄今尚未见报道。

为弥补该缺陷，本研究在北京动物园使用一次性过滤器预处理收集的大熊猫尿液样品，并进行细菌培养和代谢组学检测，以验证一次性过滤器在大熊猫尿液预处理上应用的可能性，为此后的尿液代谢组学分析研究提供高效除菌的尿液样品。通过检测健康大熊猫尿液中的代谢物种类和含量，完善圈养大熊猫代谢信息库，为疾病诊断、健康状况和发情监测等研究提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 样品采集与处理

2021 年11 月16 日—12 月8 日在北京动物园采集8 只大熊猫（3♀，5）的27 份尿液样，分为亚成年（1.5～5.5 岁）、成年（5.5～20.0 岁）和老年（20.0～27.0岁）组［17］（表1）。

表1 大熊猫基本信息Tab.1 Basic information of giant pandas

在大熊猫排尿30 min内使用一次性注射器从地面抽取6～15 mL尿液于无菌离心管中，然后分为3份分别装于离心管中，进行以下处理：第1 份不做任何处理（对照组）；第2 份使用0.22 μm Millex 过滤器（Merck KGaA，Darmstadt，Germany）过滤尿液（滤膜组）；第3份加入100 μL 0.5%叠氮钠溶液混匀（叠氮钠组）。将上述3种处理的样品放入冰盒冷藏，2 h内运回北京师范大学实验室。将上述处理过的尿液样品进行离心处理（4 ℃，15 000 r/min，10 min）除去样本中的固体杂质、颗粒悬浮物以及细胞碎片等物质［9］。对照组和叠氮钠处理组均有沉淀物产生，滤膜组离心后无沉淀物。分别取上清后在冰箱中−80 ℃保存待分析。

1.2 尿液微生物培养

为保证用于后续代谢组学检测有足够的样本量，从3种处理的尿液样品中，选择容积大于6 mL 的9 组尿液样品进行微生物培养。每组3 份共27 个尿液样品分别抽取100 μL至胰酪大豆胨琼脂（TSA）平板培养基，使用涂布器均匀涂至培养基表面，干燥，然后用封口膜密封，倒置于培养箱，37 ℃培养 24 h后取出，统计菌落个数。

1.3 核磁共振（NMR）检测与分析

针对3种方法处理的27 组共81 个尿液样本，首先进行NMR 检测前的样品制备，然后使用核磁共振波谱仪（型号AVANCE Ⅲ HD，布鲁克公司，德国）进行NMR 分析，波谱仪配备5 mm 双核z-梯度探头（BBFO 探头），设置实验温度为298.0 K。NMR 分析用尿液样品制备以及检测方法参考何清［18］。将大熊猫的尿液样本解冻后低温离心处理（4 ℃，8 000 r/min，5 min），取上清液450 μL 加入磷酸盐缓冲液（PBS）250 μL、含3-三甲基硅-2，2，3，3-D4-1-丙酸钠（TSP）的重水（D2O，氘代率99.9%）50 μL，混匀后转移到核磁管内，静置10 min 后进样分析。采用1D NOESY预饱和实验测定氢谱，谱宽SW 设置为7 000 Hz，采样点数32 k，弛豫延迟时间2 s，扫描次数128 次，在傅里叶变换之前设定FID的窗函数线宽因子为0.3 Hz，并充零到64 k。使用预饱和水峰压制技术减少水峰对其他有效溶质信号产生的影响。

利用MestReNova v12.0 软件校正对谱图相位和基线，将3-三甲基硅-2，2，3，3-D4-1-丙酸钠（TSP）峰值处定为δH特征信号化学位移的零参考值。除去δH4.3～6.2 区域以避免残存的水峰（δH4.8）以及尿素质子信号（δH5.8）的影响，选择δH0.5～10.0 区域的数据，按照每个积分间隔δH0.005 分段积分，得到123 201 个变量。将指纹谱分为3 段：A 段（δH0.5～2.8）、B 段（δH2.8～ 4.2）和C 段（δH5.3～9.5），对质谱图进行更加精确清晰的信号辨认。在多变量统计分析之前，对样本数据进行归一化处理，消除尿液总体积带来的差异［19−20］。

1.4 数据处理与分析

使用SIMCA-P v14.1（Umetrics AB，Umea，Swe⁃den）对归一化后的数据进行正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analy⁃sis，OPLS-DA），采用自适换算（unit variance scaling）的数据标度换算方式。随机多次（n=100）改变分类变量Y的排列顺序得到相应不同的随机Q2值，进行置换检验，对OPLS-DA 模型有效性做进一步的验证。根据本课题组指纹谱δH特征信号的化学位移值分析结果［18］对代谢物进行推定。

根据质谱图推定出的代谢物成分及相对含量，使用R v4.1.2 软件对不同处理方法、不同性别以及不同年龄组间大熊猫尿液中代谢物含量归一化后的数据进行t检验分析。数据以箱形图表示，统计分析皆为双尾检验，检验水平α=0.05。

2 结果

2.1 细菌生长情况

在培养箱中37 ℃培养24 h 后，滤膜过滤器处理过的尿液均未生长出可培养菌落；对照组有5 个样品长出菌落，占55.6%；叠氮钠处理组有4 个样品长出菌落，占44.4%，每份尿液样本在使用叠氮钠处理后的菌落数均少于或等于对照处理（图1）。

图1 大熊猫尿液样品微生物培养菌落生长情况（37 ℃，24 h）Fig.1 Growth of microbial colonies in urine samples of giant pandas（37 ℃，24 h）

2.2 代谢物检测结果

2.2.1 大熊猫尿液1H NMR谱图分析

根据大熊猫尿液1H NMR谱图化学位移分析，共推定21种代谢物，其中肌酐、丙氨酸、乳酸、甜菜碱和肌酸在整体样品中相对峰面积较大（表2）。

表2 大熊猫尿液样本代谢物核磁数据Tab.2 NMR data of metabolites from urine samples of giant pandas

2.2.2 3种预处理方法差异分析

通过监督性多维统计OPLS-DA 进行模型分析，滤膜处理、叠氮钠处理和对照处理间均未明显区分（图2A-C）。对照组和叠氮钠组累计解析率R2X=0.248，R2Y=0.413，Q2=−0.295；过滤组和叠氮钠组R2X=0.248，R2Y=0.34，Q2=−0.547；对照组和过滤组R2X=0.247，R2Y=0.434，Q2=−0.61。推定的21种代谢物组间均未出现显著性差异（t-test：p>0.05，图3）。这表明，采用滤膜处理和添加叠氮钠处理的大熊猫尿液样品，未对其中代谢物的组分产生影响。

图2 不同处理、不同性别间大熊猫尿液样本NMR的OPLS-DA得分Fig.2 OPLS-DA score plots based on NMR spectra of urine metabolites among three treatments and between the different sexes

图3 21种代谢物相对含量在对照组、过滤组和叠氮钠组间的差异（组间数值表示显著性，t-test）Fig.3 Comparison of 21 metabolites in three urine treatment groups（values between groups indicate significance，t-test）

2.2.3 不同性别的大熊猫尿液代谢组学的判别分析

对代谢物数据进一步分析的OPLS-DA 结果显示，雌雄组间分离不明显（图2D），累计解析率R2X=0.258，R2Y=0.348，Q2=−0.144。

1H NMR 谱鉴定结合t检验结果显示，在不同性别的大熊猫间共发现7种显著性差异代谢物（图4），其中肌酸、乳酸、α-酮戊二酸和乙酸含量在雌雄组间差异显著（p<0.05），二甲基甘氨酸、琥珀酸和反式乌头酸差异极显著（p<0.01）。

图4 7种代谢物相对含量在雌雄大熊猫间的差异（*p<0.05；**p<0.01；****p<0.000 1，t-test）Fig.4 Comparison of seven metabolites in relative content by peak area between two sexes（*p<0.05；**p<0.01；****p<0.000 1，t-test）

2.2.4 不同年龄的大熊猫尿液代谢组学判别分析

通过亚成年、成年和老年组数据构建的OPLSDA（图5）显示，成年和老年组区分较明显，累计解析率R2X=0.349，R2Y=0.817，Q2=0.387；亚成年和成年组间区分不明显，累计解析率R2X=0.279，R2Y=0.495，Q2=0.294；亚成年和老年组区分较明显，累计解析率R2X=0.358，R2Y=0.83，Q2=0.295。

图5 不同年龄间大熊猫尿液样本NMR的OPLS-DA得分Fig.5 OPLS-DA score plots based on the NMR spectra of urine metabolites among age groups

在亚成年和成年组间，二甲基甘氨酸、酪氨酸、柠檬酸和甜菜碱含量有显著差异（p<0.05），琥珀酸和反式乌头酸含量差异极显著（p<0.01）；成年和老年组间，N-乙酰基糖蛋白、丙氨酸和甜菜碱含量有显著差异（p<0.05）；亚成年和老年组间，N-乙酰基糖蛋白、二甲基甘氨酸和琥珀酸含量有显著差异（p<0.05），丙氨酸含量差异极其显著（p<0.01）（图6）。

图6 8种代谢物相对含量在亚成年、成年和老年大熊猫间的差异（*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，t-test）Fig.6 Comparison of eight metabolites among three age groups（*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，t-test）

3 讨论

通过滤膜过滤后尿液样本在离心后无沉淀产生，说明过滤膜能够阻隔杂质颗粒和细胞，并且滤膜过滤后的大熊猫尿液经细菌培养未发现菌群产生（图1）。因此，滤膜过滤处理具有除菌、除杂质的功能，操作简便快捷，可减少样品在常温中暴露的时间，利于尿液样品收集和保存。

采样污染对代谢组学结果的影响主要来源于细菌的增值和代谢［21］，滤膜可以有效降低采样过程中细菌的污染，而多变量分析OPLS-DA 结果以及代谢物组间比较结果显示滤膜处理、叠氮钠处理和对照处理组之间代谢物组成无明显区别（图2，图3）。Eisinger等［8］研究表明，尿液样本暴露于15 ℃以上 2 h 后污染性微生物大量繁殖，对代谢物产生较大影响。本次大熊猫尿液样本采集于北京11—12 月的清晨，记录的平均采样环境温度为（8.4±3.6）℃，最高环境温度为15.0 ℃。组间未产生差异的因素可能是环境温度低，微生物代谢物速率减慢［10］，并在采样后2 h 内置入−80 ℃冷藏。但微生物对尿液样品的影响仍不容小觑，细菌的繁殖会消耗柠檬酸盐、肌酐等物质，产生三甲胺、甲酸、乳酸和肌酸等，使尿素分解，造成尿液pH 升高，尿液成分改变，影响代谢组学的检测结果［10，21］。在适宜微生物生长代谢的环境

收集尿样时，对尿液的处理很有必要，尤其是在温度更高的夏天。此外，在低温条件下采样，3种方法处理后的代谢物分析结果也表明，滤膜处理、叠氮钠处理没有影响代谢物组成及丰度（图2，图3）。因此，滤膜过滤可以应用于大熊猫尿液代谢组学检测的尿液预处理工作。

不同性别间，大熊猫尿液代谢物在总体上没有明显的区分（图2D）。在采集尿液样品时，8 只大熊猫均处于非发情期，食谱相似，圈养条件一致，受到游客噪声等环境因子的影响也相似，雌性和雄性大熊猫都处于健康和正常的状态。不过，根据代谢物的相对含量，发现7种代谢物存在显著差异（图4），可能与竹子各部位胆碱的含量不同，二甲基甘氨酸含量的差异可能与雌雄喜食的竹子部位不同有关［2］。雄性大熊猫肌肉质量大，肌酸含量多［20］。生物体的性别会极大地影响雌性和雄性的激素水平，而激素水平会引起生物体内代谢通路的变化［3］。雌激素可以增加脂肪酸的利用率，同时降低糖异生作用［22］。

不同年龄间大熊猫代谢物组成存在差异（图5，图6），从亚成年发育到成年阶段，食量增加引起代谢变化，因此与三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA cycle）等生理代谢途径相关的柠檬酸、琥珀酸等含量都有增加。酪氨酸由苯基丙氨酸合成，在酪氨酸酶催化和一系列氧化反应下生成黑色素［23］，而柠檬酸、酪氨酸也被证明是雄性大熊猫自然交配成功与否的差异代谢物［24］。

本研究通过微生物培养和代谢组学手段相结合，检验了一次性过滤器在代谢组学尿液处理中的可行性，为大熊猫和其他动物尿液代谢组学预处理提供了简便快捷的处理方法。通过指纹图谱的指认分析，共得到21种代谢物，多变量分析结果显示，雌雄大熊猫在非繁殖期代谢物组成类似，无明显区别；亚成年-成年组间代谢物组成没有明显的区别，亚成年-老年组间有一定的区别，成年-老年组间有明显区别。本研究丰富了大熊猫的基本代谢组学库，为大熊猫疾病监测、繁殖期的判断和应激状态内在机制的研究提供了数据基础，同时也为其他圈养哺乳动物应用该技术开展尿液代谢组学及相关研究工作创造了条件。