山羊痘病毒和绵羊痘病毒荧光PCR检测方法的建立与应用

啜微微 耿庆华 赵永刚 孟祥勇 张敏 韩小虎 赵治国 付海滨

(1.沈阳海关技术中心，辽宁 沈阳 100016；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东 青岛 266033；3.沈阳农业大学，辽宁 沈阳 110866；4.呼和浩特海关技术中心，内蒙古 呼和浩特 010020)

山羊痘和绵羊痘是由痘病毒科的羊痘病毒属(CaPV)[1]引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，症状为发热、皮肤出现痘疹等。目前，小型反刍动物(绵羊和山羊)的CaPV感染分布广泛，在非洲北部和中部、中东、欧洲和亚洲高度分布[2]，在世界较多国家和地区常有发生，造成巨大的畜牧经济损失。我国农业部将其确定为一类动物传染病，也是中华人民共和国进境动物检疫疫病名录一类动物传染病。近年来，我国随着各地羊养殖数量增加，流通交易频繁，各地也有羊痘疫情的发生[3，4]。目前羊痘诊断主要依靠临床症状进行判断，采用疫苗免疫后，部分羊不出现明显痘疹，但仍然带毒排毒。因而临床出现漏诊及病毒污染范围评估困难等情况。

近几年，我国口岸进境活体山羊、冷冻羊肉及其制品逐年增多，按照海关总署国门生物安全监控方案，需要对这些商品检测山羊痘和绵羊痘病毒。而目前现有国家标准和检验检疫行业标准中均没有山羊痘和绵羊痘的分子生物学检测方法，农业部标准中也仅有PCR方法，暂时没有荧光PCR方法。普通PCR方法，检测时限较长，灵敏度较低，本研究选取山羊痘病毒P32基因序列保守区域作为检测对象，建立了检测山羊痘和绵羊痘病毒的荧光PCR检测方法，为海关口岸实验室羊痘病毒检测标准的建立提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及相关病毒核酸

山羊痘活疫苗、羊败血性链球菌病灭活疫苗、山羊传染性胸膜肺炎灭火疫苗和羊败血性链球菌病灭活疫苗购自哈药集团生物疫苗有限公司；口蹄疫O型/A型二价疫苗和小反刍兽疫活疫苗购自天康生物股份有限公司，布氏杆菌病活疫苗购自重庆澳龙生物制品有限公司，羊口疮弱毒细胞冻干活疫苗购自青海省畜牧生物生物药品制造厂。山羊痘P32基因阳性质粒由本实验室构建并保留；山羊痘细胞灭活病毒、绵羊痘细胞灭活病毒，小反刍兽疫病毒核酸，蓝舌病毒核酸，口蹄疫O型病毒核酸，口蹄疫亚洲1型病毒核酸，Q热病毒核酸，山羊关节炎脑炎病毒核酸，羊口疮病毒核酸，羊布氏杆菌病原核酸由中国动物卫生与流行病学中心国家外来动物疫病监测与研究中心馈赠。

1.1.2 仪器设备与试剂

QuantStudio5荧光PCR仪(Thermo公司)；EX3600全自动核酸提取仪(上海之江生物科技股份有限公司)；病毒核酸提取试剂盒，SuperReal PreMix(Probe)，RNase-Free ddH2O购自天根生化科技有限公司(TIANGEN)。引物、探针由上海生工生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 引物和探针设计与合成

参考GENEBANK(MT521862.1)山羊痘P32基因序列设计引物和探针序列。用RNase-Free ddH2O溶解至100μmol，-20℃保存。山羊痘P32基因通过全基因合成并连接于pUC57载体。引物P1和P2以及TaqMan探针P3用于建立山羊痘和绵羊痘的荧光PCR检测方法。

表1 引物和探针序列

1.2.2 荧光PCR反应体系及反应条件的优化

提取山羊痘病毒和绵羊痘细胞灭活病毒核酸，初步使用的荧光PCR反应体系为25μL，其中2×real-time qTaq Mix 12.5μL，浓度为10μmol·L-1的P1、P2和TaqMan探针P3各1μL，DNA模板10pg，最后用去离子水补至25μL。荧光PCR的反应条件：在95℃变性2min；在95℃变性5s，分别选择55℃和60℃退火/延伸30s的条件下进行45个循环，每次循环分别在55℃和60℃测定荧光值。荧光PCR反应的优化主要在退火/延伸温度和时间2方面进行，其它条件不变。退火/延伸温度在55℃和60℃2个温度下进行优化；确定了退火/延伸温度后再进一步对延伸时间进行优化，分别在40s、30s、20s和10s进行延伸。结果表明，所有的时间长度均可以获得很好的检测曲线。因此，该荧光PCR反应中的延伸时间确定为10s。

1.2.3 荧光PCR敏感性试验

将山羊痘P32基因阳性质粒模板DNA用核酸测定仪测定浓度，进行10倍倍比稀释为1.0×108～1.0×100copies·mL-1的浓度梯度，以这些不同浓度的质粒作为模板进行荧光PCR检测，根据检测结果确定该方法的敏感性。

1.2.4 荧光PCR特异性试验

利用商品化的试剂盒提取健康羊的基因组DNA、灭活的绵羊痘病毒细胞培养物、山羊痘活疫苗、羊败血性链球菌病灭活疫苗、山羊传染性胸膜肺炎灭火疫苗、羊口疮弱毒细胞冻干活疫苗、羊败血性链球菌病灭活疫苗、口蹄疫O型/A型二价疫苗、小反刍兽疫活疫苗、布氏杆菌病活疫苗核酸，以及由中国动物卫生与流行病学中心国家外来动物疫病监测与研究中心馈赠的小反刍兽疫病毒核酸、蓝舌病毒核酸、口蹄疫O型病毒核酸、羊口疮病毒核酸、口蹄疫亚洲1型病毒核酸、Q热病毒核酸、山羊关节炎脑炎病毒核酸和羊布氏杆菌病原核酸为模板分别进行荧光PCR检测，根据检测结果确定荧光PCR的特异性。

1.2.5 荧光PCR的重复性试验

以1.0×108～1.0×101copies·mL-1羊痘P32基因质粒为模板进行荧光PCR分析，分别进行批内和批间重复试验，根据实验结果确定该方法的稳定性。所有的实验结果均通过Origin统计学软件进行分析。

1.2.6 模拟样品的制备与检测

实验室将羊的相关传染病的商品化疫苗、健康羊肉和羊血清按一定比例制成以下样品：羊痘疫苗PBS悬液2份作为阳性对照(样品编号为1～2)；经灭活的山羊痘病毒细胞培养物和健康羊肉制成的匀浆液分别按照1∶1、1∶2、1∶3的比例各1份(样品编号为3～5)；经灭活的绵羊痘病毒细胞培养物和健康羊血清分别按照1∶1、1∶2、13的比例制成混合液各1份(样品编号为6～8)；健康羊肉PBS悬液、小反刍兽疫活疫苗PBS悬液、口蹄疫O型/A型二价疫苗PBS悬液、山羊传染性胸膜肺炎灭活疫苗PBS悬液、羊败血性链球菌病灭活疫苗PBS悬液、布氏杆菌病活疫苗PBS悬液各1份(样品编号为9～14)；共计14份样品，提取模板核酸后，按照上述方法进行荧光PCR扩增，进行羊痘病毒的检测。

2 结果

2.1 山羊痘和绵羊痘病毒荧光PCR探针和引物的设计

P32基因是山羊痘和绵羊痘病毒特异性基因，将该基因序列在GeneBank上进行Blast比对，P32基因序列具有高度保守性，在保守序列中设计引物和Taqman探针，如表1所示，靶序列片段大小为120bp。用设计的引物和探针对山羊痘和绵羊痘细胞灭活毒进行检测，同时设置10个重复的阴性对照，结果如图1所示，所有阴性对照在45个循环内均不起峰，而山羊痘和绵羊痘细胞灭活毒获得很好的扩增效果，这些结果初步表明，该引物和探针能用于山羊痘和绵羊痘病毒的检测。

注：A为山羊痘病毒；B为绵羊痘病毒。

2.2 荧光PCR反应条件的优化

在利用荧光PCR方法检测病原过程中，退火和延伸温度以及延伸时间是影响检测方法好坏的关键因数，对这2个条件进行了优化。由于荧光PCR检测方法中退火和延伸一般是在一个温度条件下同时进行，因此在这个步骤中用商品化山羊痘疫苗核酸作为模板，优化了2个温度，分别是55℃和60℃，结果如表2所示，在这2个温度下进行退火/延伸的扩增结果没有明显区别，因此选择60℃作为荧光PCR的退火/延伸温度。确定了退火/延伸温度后再进一步对延伸时间进行优化，分别在40s、30s、20s和10s进行延伸。结果如图2所示，所有的时间长度均可以获得很好的检测曲线。因此，该荧光PCR反应中的延伸时间确定为10s。

表2 不同退火/延伸温度下检测的Ct值比较

图2 不同延伸时间下荧光PCR检测结果

2.3 荧光PCR检测方法敏感性的确定

为了确定该荧光PCR方法检测的敏感性，对其检测限进行了确定。将p32基因的质粒从1×108copies·mL-1进行10倍系列稀释至1×100copies·mL-1，然后对这些稀释的标准阳性模板进行荧光PCR扩增，结果如图3所示，检测结果为1.0×108～1.0×103copies·mL-1浓度梯度的CT值分别为19.81、24.26、27.37、28.43、30.37、33.37、37.70，且均有典型的S型扩增曲线；1.0×102～1.0×101copies·mL-1浓度梯度的CT值分别为41.07和42.40，但2个扩增曲线不明显；1×100copies·mL-1的质粒样品检测为阴性，因此该荧光PCR方法的检测限为1000copies·mL-1。

2.4 荧光PCR检测方法特异性的实验

为了进一步确定建立的荧光PCR检测方法的特异性，用该方法检测1.6中提到包括羊的基因组、羊的多种常规传染病的病毒和核酸。如图4所示，在所有检测结果中只有山羊痘和绵羊痘检测出阳性，其它核酸检测均为阴性。这些结果表明建立的荧光PCR检测方法具有高度的特异性。

注：1～9依次为1×108～1×100copies·mL-1；10为阴性对照。

图4 荧光PCR特异性检测

2.5 荧光PCR重复性实验结果

为了确定荧光PCR检测方法的稳定性，以1×108～1×101copies·mL-1的标准质粒为模板进行重复性检测，重复性检测的Ct值分析结果如表3所示，结果表明，1×108～1×103copies·mL-1不同浓度标准质粒检测的组间和组内Ct值均小于38，且扩增曲线明显，变异系数均小于3%；而1×102～1×101copies·mL-1，Ct值均大于40，且扩增曲线不明显。因此，该检测方法具有良好的重复性。可以初步确定Ct值小于38且扩增曲线明显，检测结果判定阳性的，而当Ct值大于38小于45，且扩增曲线不明显时判为疑似。

2.6 模拟样品的检测

实验室将羊的相关传染病的商品化疫苗、健康羊肉和羊血清按一定比例制成1.8中所述混合液样品14份，提取核酸后，按照上述方法进行荧光PCR扩增，结果如图5所示，2份羊痘疫苗PBS悬液，灭活的绵羊痘病毒细胞培养物和健康羊肉制成的匀浆液(1∶1、1∶2、1∶3)，灭活的绵羊痘病毒细胞培养物和健康羊血清混合液(1∶1、1∶2、1∶3)等8份样品为阳性，其他6份样品均为阴性，与预期结果相符合。

表3 荧光PCR组内和组间重复性试验结果

注：1～2为1～2号样品；3为3号样品；4为6号样品；5为4号样品；6为7号样品；7为5号样品；8为8号样品。

3 讨论

CaPV的传播主要通过直接接触受污染的呼吸道飞沫或通过受污染的环境和载体间接接触[5]。然而，这些病毒可以在环境中存活很长时间。因此，受污染动物活动是病原体传播的最重要原因[6，7]。临床上，受感染的羊出现发烧、皮损、结膜炎伴眼鼻分泌物、流涎过多、全身性皮肤丘疹或结节，这些丘疹或结节可能会扩散到呼吸系统和胃肠道系统[8]。

山羊痘和绵羊痘是小型反刍动物最重要的病毒性疾病，该病在各地的流行会造成绵羊和山羊严重的生产损失，其限制了国际贸易并造成其他的经济损失[9，10]。因此，世界动物卫生组织(WAHO)将CaPV归类为法定传染病，因为其具有快速的跨界传播，对畜牧业产生广泛的经济影响[11，12]。在全球范围内，这种疾病对小型反刍动物生产和粮食安全造成严重威胁，并危及国际贸易[13]。据世界动物卫生组织报道，2010—2022年该病在包括保加利亚、中国台北、以色列、哈萨克斯坦、吉尔吉斯斯坦、蒙古、摩洛哥、希腊和俄罗斯等国家或地区曾有发生，在希腊、以色列和俄罗斯等国家反复多次发生，呈地方性流行，给当地养殖业造成了很大的影响。2022年4月蒙古向世界动物卫生组织(WAHO)紧急报告发生绵羊痘和山羊痘疫情，涉及2747只绵羊，其中95只发病，死亡13只。

近几年，国境口岸进境活体山羊、绵羊和冷冻羊肉及其制品逐年增多，给山羊痘和绵羊痘的传入带来很大风险。按照相关要求海关实验室要对这些动物和产品依照标准方法检测山羊痘和绵羊痘病毒。而目前现有国家标准、农业部标准和检验检疫行业标准中均没有山羊痘和绵羊痘的荧光PCR检测方法。本研究即是为口岸动物检疫实验室检测山羊痘病毒和绵羊痘病毒建立标准方法而开展，研究中选用P32基因作为目标检测基因，因为绵羊痘病毒、山羊痘病毒的表面膜蛋白P32基因序列高度保守，在核苷酸水平上同源性为97.5%，在氨基酸水平上同源性为94.7%[14，15]。

本研究经过对荧光PCR反应的退火温度、延伸时间的摸索，确定了检测最佳反应条件，同时经过多次批内和批间的重复试验，初步确定了检测山羊痘和绵羊痘病毒荧光PCR检测方法判定阳性的Ct值为小于38，而当Ct值大于38小于45时判为疑似。判为疑似的样品，对于海关进境活体羊可以重新采样再检测，进境的羊肉制品可以扩大抽样范围再行检测。

研究中多次采用商品化的山羊痘疫苗作为实验室检测过程中的阳性质控样品，结果非常稳定准确。在动物检疫实验室，由于生物安全的要求，以往的实验室在检测过程中一般采用合成特异基因的质粒作为阳性质控样品，但是以质粒作为阳性质控，如果浓度控制不好很容易引起气溶胶污染；而且质粒只能作为PCR反应的过程中的阳性质控，不能作为核酸提取过程中的质控样品。本研究采用商品化山羊痘疫苗作为检测过程的阳性质控，与被检样品一起经过核酸提取、荧光PCR反应和检测结果读取等过程，可以作为整个检测过程中的质控样品。同时还可以用于海关等动物检疫实验室人员培训和上岗中的考核样品。为该方法的标准化及更好的在动物检疫实验室中应用提供了依据。