副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测试剂盒的研制与应用

张鹏云，陈敏，刘明星，周红，蔺辉星，范红结

副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测试剂盒的研制与应用

南京农业大学动物医学院，南京 210095

【背景】副猪嗜血杆菌（，HPS）是猪的上呼吸道病原菌，引起格拉瑟氏病，主要引起断奶前后和保育阶段的猪发病，通常见于5—8周龄的青年猪，发病率一般为10%—15%。该菌有15种血清型，目前主要养猪国家流行的血清型为4型、5型、12型和13型，是严重危害养猪业发展的主要细菌性病原之一。目前国内还没有检测该菌抗体的商品化试剂盒。【目的】研制一种针对副猪嗜血杆菌的快速、敏感和特异性强的抗体检测试剂盒，为格拉瑟氏病的有效防控提供技术支持。【方法】表达并纯化OppA、DppA、HbpA 3种不同的副猪嗜血杆菌ABC转运体周质底物结合蛋白，使用副猪嗜血杆菌阴、阳性参考血清筛选以上3种蛋白中免疫反应性和反应特异性好的蛋白。以筛选的蛋白为包被抗原，建立检测HPS抗体的间接ELISA方法，优化间接ELISA 反应条件，并组装试剂盒。在此基础上，确定该试剂盒的敏感性、特异性；通过对不同时间、不同猪场采集的2 000份临床猪血清样本进行检测，评价该试剂盒的实用性；在以上临床血清样本中随机选取200份，分别以研制的试剂盒、间接血凝试验以及进口商品化试剂盒进行检测，比较检测结果，验证该试剂盒的符合率；最后，使用研制的试剂盒检测免疫和攻毒猪采集的血清，评价该菌免疫后的抗体消长规律。【结果】成功表达并纯化了OppA、DppA、HbpA 3种蛋白，发现OppA免疫反应性和反应特异性最好。经过反应条件优化，确定OppA包被浓度为1 μg·mL-1，封闭液为0.5%的BSA-PBS溶液，样品稀释液为1%的BSA-PBST溶液，样品孵育时间为30min，样品稀释度为1﹕50，酶标二抗孵育时间为3 0min，底物作用时间为15 min，临界值为0.18；试剂盒的敏感性和特异性为96.67%，能与国内常见血清型HPS阳性血清反应而不与猪其他常见病原阳性血清发生交叉反应；2 000份临床血清样本阳性检出率为34.65%；随机抽取200份血清样本，与间接血凝试验的符合率为92.50%，与进口商品化试剂盒符合率为87.00%，符合率较高；使用试剂盒检测免疫和攻毒后不同时间采集的猪血清，HPS抗体消长规律符合预期。【结论】研制的副猪嗜血杆菌ELISA抗体检测试剂盒特异性高、敏感性强，与商品化试剂盒和间接血凝试验的符合率高，可用于临床HPS抗体检测和疫苗免疫效果评价。

副猪嗜血杆菌；ABC转运体周质底物结合蛋白；间接ELISA；免疫评价

0 引言

【研究意义】副猪嗜血杆菌（，HPS）是猪的机会致病菌，为巴斯德菌科、嗜血杆菌属的革兰氏阴性菌[1-2]，主要引起1—4月龄猪的呼吸道感染，造成格拉瑟氏病，以纤维蛋白性多浆膜炎、多关节炎和脑膜炎为临床特征，死亡率可高达 50%[3-4]。该菌易与其他猪呼吸道病原发生共感染，危害更加严重[5-8]。2019年，农业农村部宣布猪用饲料全面禁止添加抗生素，格拉瑟氏病在猪场流行愈发严重，给养殖业造成了极大损失[9]。该病诊断主要通过临床症状、病理病变以及病原菌的分离鉴定，但这些方法操作复杂，耗时长[10-11]；血清学诊断快速、敏感，但该病目前还缺乏血清学诊断国家标准[1, 4]。因此，有必要建立一种血清学诊断方法，用于该病的流行病学调查和疫苗评价。【前人研究进展】研究人员已建立多种血清学方法对该病进行诊断，包括补体结合试验、间接血凝试验（IHA）和酶联免疫吸附试验等[11-14]。其中，间接血凝试验主要以高温煮沸的细菌上清、OppA为致敏抗原，但是操作繁琐，重复性差；使用抽提的HPS多糖、脂多糖或单体自转运蛋白rApd建立的间接ELISA方法，可用于HPS抗体检测，但反应敏感性和特异性差，结果不稳定[15]。在革兰氏阴性细菌中，ABC转运体周质底物结合蛋白（SBP）能结合细菌周质中的底物并将其转移到细胞质内，是开发抗菌剂和疫苗的潜在靶标[16-18]。OppA、HbpA和DppA是常见的SBP蛋白，在寡肽转运和血红素转运等方面发挥作用[19-22]。MACEDO等研究表明10株HPS临床分离株和13株HPS参考菌株中均表达OppA，而猪常见的10种其他细菌的全菌蛋白均不表达OppA，说明OppA在HPS中保守，且不与其他猪病原菌发生交叉反应[11]。【本研究切入点】副猪嗜血杆菌给养殖业造成较大危害，已经报道的血清学诊断方法敏感性、特异性低，而国内市场上没有该病的ELISA试剂盒，进口试剂盒价格昂贵，无法满足检测需求。【拟解决的关键问题】筛选HPS抗体检测最适包被抗原，优化ELISA反应条件，建立高敏感性和特异性的ELISA试剂盒，并进行大量临床试验，与间接血凝试验和进口试剂盒比较。为副猪嗜血杆菌的快速检测、诊断、流行病学调查和疫苗评价提供技术支持。

1 材料与方法

试验于2018年10月至2021年10月在南京农业大学动物医学院兽医微生物与免疫实验室进行。

1.1 细菌与血清

副猪嗜血杆菌SQ株由南京农业大学动物医学院兽医微生物与免疫学试验室保存。48份副猪嗜血杆菌阴阳性参考血清，10份特异性质控血清（包括9份猪其他病原阳性血清），6份国内常见血清型阳性血清以及免疫猪和攻毒猪血清，均由该实验室制备、检验和保存，所有血清均使用副猪嗜血杆菌间接血凝试验检验[14]，血清型特异性血清使用KRG方法检验特异性[23]。猪临床血清采自周边不同猪场。

1.2 主要试剂和仪器

HRP 标记羊抗猪抗体购自北京庄盟生物有限公司；进口副猪嗜血杆菌间接 ELISA 试剂盒购自加拿大Biovet公司；单组分TMB 显色液购自北京索莱宝科技有限公司；酶标仪Infinite 200 PRO NanoQuant购自瑞士TECAN公司。

1.3 引物

研究所用引物均由南京金斯瑞生物科技股份有限公司合成（表1）。

表1 引物序列

斜体带虚线碱基为酶切位点 Dashed bases in italics are restriction sites

1.4 重组表达菌株的构建与重组蛋白的表达、纯化和鉴定

以副猪嗜血杆菌 SH0165（GenBank 登录 CP001321.1）在 NCBI 上公布基因序列为参考，设计和表达引物。以HPS-SQ株基因组为模板PCR 扩增3个片段，并和pET28a进行对应双酶切， T4 DNA 连接酶连接，将产物转化进DH5α 感受态细胞，均匀涂布于含有卡那霉素（50 ng·μL-1）的LB平板，PCR和酶切分别鉴定重组质粒，阳性克隆送测序。提取重组质粒转化入BL21（DE3）感受态细胞，即为重组蛋白表达菌。蛋白表达和纯化使用文献[24]方法。挑取单克隆在37℃培养过夜，扩大培养至OD600约0.6—1.0，加入0.1 mmol·L-1IPTG，16℃、200 r/min转速下继续培养20 h，收集细胞，破碎后于4℃以12 000r/min离心20 min收集上清，经0.45 μm滤膜过滤后上镍柱，利用不同浓度的咪唑进行梯度洗脱，收集洗脱液进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色，使用副猪嗜血杆菌阳性血清经Western-blot鉴定蛋白特异性。收集蛋白，使用BCA 试剂盒检测蛋白浓度，-80℃冻存。

1.5 副猪嗜血杆菌间接ELISA抗原的选择和间接ELISA试剂盒的建立

分别采用2 μg·mL-1的rOppA、rHbpA和rDppA包被的酶标板检测48份阴阳性参考血清，间接ELISA方法按照常规方法操作[25-26]。选取效果最佳的蛋白，优化抗原包被浓度、最佳封闭液、样品稀释度、最佳样品稀释液、样品反应时间、二抗稀释液、二抗工作浓度、二抗反应时间和底物反应时间等，根据 OD 值和 P/N 值建立间接 ELISA 方法。统计试制的副猪嗜血杆菌ELISA抗体检测试剂盒检测60份阳性血清和60份阴性血清的结果，通过ROC曲线分析[27]，确定副猪嗜血杆菌ELISA抗体检测方法的临界值，从而建立HPS抗体检测试剂盒。

1.6 特异性、敏感性检验

取9种实验室制备保存的猪其他常见病原阳性血清，用试剂盒进行检测，研究其特异性；取6种实验室制备保存的副猪嗜血杆菌国内常见标准血清型特异性阳性血清，用试剂盒进行检测，研究其敏感性。

1.7 符合率和临床应用

用试剂盒检测来自5个省份不同时间采集的共2 000份临床血清样品，计算其阳性率。在临床样品中随机抽取200份，用试剂盒和间接血凝试验[14]以及商业化试剂盒同时检测这些临床血清，计算阴阳性检出率和符合率；用试剂盒检测使用副猪嗜血杆菌相隔两周两次攻毒和使用商业化疫苗相隔两周两次免疫不同时间采集的血清，分析其抗体强度变化。

2 结果

2.1 蛋白的表达、纯化、鉴定和筛选

表达3种蛋白，大小均在预期范围内（图1-A），纯化后得到纯度较高的目的蛋白（图1-B），使用副猪嗜血杆菌阳性血清经Western-blot鉴定蛋白特异性（图1-C），BCA试剂盒测量蛋白浓度。分别使用2μg·mL-1的蛋白包被酶标板，检测48份阴阳性参考血清，结果显示，rOppA蛋白检测的OD450值可以明显区分出阴阳性血清，而rHbpA和rDppA不明显（图1-D），因此，选择rOppA作为间接ELISA包被抗原。

A：3种蛋白的表达; M:蛋白标准, 1：空质粒表达菌，2-4： rOppA、rDppA和rHbpA表达菌株；B：3种蛋白的纯化M:蛋白标准, 1-3：rOppA、rDppA和HbpA蛋白；C：3种蛋白的鉴定M：蛋白标准, 1-3：rOppA、rDppA和HbpA蛋白；D：抗原的筛选

2.2 ELISA条件的优化和试剂盒的建立

以rOppA包被酶标板，进行条件优化，根据 OD 值和 P/N 值确定了最佳抗原包被浓度为1 μg·mL-1、最佳封闭液为0.5%的BSA-PBS溶液、最佳样品稀释液为1%的BSA-PBST溶液、最佳样品孵育时间为30 min、最佳样品稀释度为1﹕50、最佳酶标二抗稀释度为1﹕20 000、最佳酶标二抗孵育时间为30 min、最佳底物孵育时间为15 min。根据已优化的条件，检测60份阳性血清和60份阴性血清，统计其OD450nm（图2-A），绘制ROC曲线（图2-B），结果显示，当OD值＜0.1789时，敏感性和特异性较高，均为96.67%，选择该OD值作为临界值，即当OD450nm≥0.18时，判定为HPS抗体阳性，当OD450nm＜0.18时，判定为HPS抗体阴性，此时，ROC曲线下面积（AUC）最大，为0.9972。

2.3 特异性、敏感性检验

取猪其他常见病原阳性血清，包括猪大肠杆菌阳性血清（）、猪胸膜肺炎放线杆菌阳性血清（App）、猪肺炎支原体阳性血清（Mhp）、猪链球菌2型阳性血清（SS2）、猪丹毒丝菌阳性血清（Ery）、经典猪瘟阳性血清（CSFV）、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒阳性血清（PRRSV）、猪圆环病毒2型阳性血清（PCV2）和猪伪狂犬病阳性血清（PRV），用试剂盒进行检测，发现9种血清均检测为阴性（图3-A），说明试剂盒与猪常见其他病原的抗体不发生交叉反应；取制备的副猪嗜血杆菌国内常见血清型特异性阳性血清，包括血清1型、血清4型、血清5型、血清12型、血清13型和血清14型，用试剂盒进行检测，结果均检测为阳性（图3-B）。

A：rOppA-ELISA检测120份阳性和阴性猪血清的结果分布；B：ROC曲线

A：特异性检验；B：敏感性检验 A: The result of specificity test; B: The result of sensitivity test

2.4 临床样品检测

使用试制的试剂盒检测来自江苏、安徽、浙江、山东和河南等不同省份猪场采集的两批共2 000份临床血清，总阳性率为34.65%，其中2019年5月采集的5个省份共1 000份血清中，抗体阳性率范围为17.45%— 35.88%，总阳性率为24.80%；2020年11月采集的相同猪场共1 000份血清中，抗体阳性率范围为36.36%— 54.12%，总阳性率为44.50%（表2），均有较大幅度上涨。

2.5 试剂盒符合率研究

通过检测200份随机临床血清，发现本试剂盒与国外进口试剂盒的符合率为87.00%，与间接血凝试验符合率为92.50%（表3），其中，进口试剂盒将18份血清判定为疑似，这18份疑似血清中，有8份血清的检测结果与IHA相同，另外10份与IHA结果不同。

2.6 检测免疫猪和攻毒猪血清样本

采用试剂盒检测免疫猪和攻毒猪血清样本，其中PBS组4头猪4周内均为阴性，疫苗组直到二免后一周才产生抗体，有一头猪的血清始终为阴性的，可能为免疫失败（图4-A）。通过腹腔注射感染副猪嗜血杆菌强毒菌株SQ株的5头猪的血清在第一次攻毒后第7天开始已经产生抗体（图4-B）。

表2 临床试验结果

表3 符合率试验

3 讨论

由于传统的副猪嗜血杆菌血清学诊断方法存在缺陷，急需使用有优势的ELISA方法进行取代[15]。遗憾的是，我国的副猪嗜血杆菌病ELISA检测试剂盒完全依赖进口，目前仍然没有被批准上市的国产ELISA试剂盒。笔者通过筛选到的一种特异性和敏感性较好的蛋白作为包被抗原，建立了ELISA试剂盒，该试剂盒经过与间接血凝试验和进口商业化试剂盒进行比较，符合率高。

3.1 包被抗原的选择和试验条件的优化

目前已经建立的ELISA方法多采用细菌脂多糖和外膜蛋白作为包被抗原，但是试验证明脂多糖和外膜蛋白均易与其他细菌的血清发生交叉反应。使用HPS单体自转运蛋白Apd作为包被抗原建立间接ELISA方法，同样可以识别HPS 15种血清型参考菌株，但是该研究只是使用了Wetern-blot方法进行验证[15]；近年来，神经氨酸酶蛋白Neu也被报道作为ELISA的检测抗原[28]。OppA属于ABC转运体周质底物结合蛋白，该类蛋白具有能刺激机体产生较强抗体水平的特点[29-30]。有研究显示，OppA蛋白在副猪嗜血杆菌中保守，且在其他常见猪细菌病原中不存在，可称是优质的检测用抗原，该研究建立了OppA-ELISA方法，不过并未对建立的ELISA方法进行特异性和敏感性研究[11]。本研究为OppA可以作为HPS的诊断抗原提供了更充足的证据。

A：商业灭活疫苗免疫组；B：强毒株SQ攻毒组

3.2 试剂盒临界值的设定

合理的临界值对于ELISA试剂盒的准确性至关重要[31]。在间接ELISA方法的建立研究中，多直接使用检测OD值作为判定依据[32]，或使用样品检测值与阳性对照值的比值S/P作为判定依据[33]。由于在ELISA检测中阴性对照的检测值最为稳定，受人为和环境的影响较小，所以本研究使用了P/N值作为阴阳性判定的依据。在前人对于HPS间接ELISA方法的研究中，临界值的确定均使用了检测阴性样品平均值X±3SD法[34]，这种方法已逐渐被ROC曲线法所取代，ROC曲线法是目前ELISA试剂盒研制中常用的方法之一[35]。

3.3 试剂盒敏感性和特异性评价

在前人的研究中，多未对建立的副猪嗜血杆菌ELISA方法进行全面的敏感性和特异性研究。Neu-ELISA方法未对猪大肠杆菌阳性血清和猪肺炎支原体阳性血清做出研究，不足以完全说明试验的特异性[28]；在研究Apd-ELISA方法时，敏感性和特异性研究使用了免疫印迹法，该方法只能证明相应菌株中是否存在与Apd多克隆抗体发生反应的蛋白，无法说明对应的抗体是否与Apd重组蛋白发生反应[15]，这种方法验证ELISA的敏感性和特异性可能存在较大的局限性。本研究建立的ELISA试剂盒，敏感性和特异性均达到了96.67%，并对试剂盒是否可以检出6种我国常见血清型阳性血清以及9种猪常见病原阳性血清做出了研究，充分证明了OppA作为诊断抗原的可行性。

3.4 试剂盒实用性评价

OppA-ELISA检测免疫猪抗体产生的规律与Apd-ELISA方法检测的结果基本一致，两种方法均无法区分临床感染猪和人工免疫猪[15]；使用Apd-ELISA方法检测330份临床血清的阳性率为17.88%，全菌ELISA检测相同样本的阳性率为87.88%[15]，虽然全菌ELISA法的特异性普遍较差，但是，过大的差距同样可能是Apd-ELISA法敏感性偏低造成的。根据统计，我国副猪嗜血杆菌病在200—2019年的综合患病率为27.8%[36]，本研究制备的OppA- ELISA法检测的2 000份临床样本阳性率为34.65%，其中2019年之前约为24.80%，与相关结果基本吻合。有人对Apd-ELISA与荷兰Biocheck试剂盒（OppA- ELISA）进行了对比，结果阳性符合率仅为4.76%（6/126），反而与OppA免疫印迹法的检测结果符合率为73.02%（92/126）[34]，考虑到本研究制备的OppA-ELISA试剂盒与Apd-ELISA试剂盒在免疫猪HPS抗体产生规律上的一致性，造成这种差异的原因可能是Biocheck试剂盒将临界值设置偏高，导致敏感性不足所致，本研究制备的试剂盒临界值比Biocheck试剂盒更为合理，提高了该检测的敏感性，具有更广的应用价值。

4 结论

本研究表达、纯化3种不同的副猪嗜血杆菌ABC转运体周质底物结合蛋白，经过筛选，选择了OppA作为包被抗原，建立了副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测试剂盒，该试剂盒特异性和敏感性强，与间接血凝试验和进口商业化试剂盒符合率高，可用于临床应用。

[1] HE L Q, WEN X T, YAN X F, DING L Q, CAO S J, HUANG X B, WU R, WEN Y P. Effect of cheY deletion on growth and colonization in aserovar 13 clinical strain EP3. Gene, 2016, 577(1): 96-100.

[2] 杨君, 楚品品, 宋帅, 蔡汝健, 杨冬霞, 卞志标, 勾红潮, 李艳, 蒋智勇, 李春玲, 闫鹤. 副猪嗜血杆菌ⅠpxM基因缺失株构建及生物学特性分析. 中国农业科学, 2020, 53(16): 3394-3403. doi:10.3864/ j.issn.0578-1752.2020.16.016.

YANG J, CHU P P, SONG S, CAI R J, YANG D X, BIAN Z B, GOU H C, LI Y, JIANG Z Y, LI C L, YAN H. Construction of ⅠpxM gene deletion strain ofand it s some biological characteristics. Scientia Agricultura Sinica, 2020, 53(16): 3394-3403. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.16.016. (in Chinese)

[3] OLIVEIRA S, PIJOAN C.: new trends on diagnosis, epidemiology and control. Veterinary Microbiology, 2004, 99(1): 1-12.

[4] OLVERA A, SEGALÉS J, ARAGÓN V. Update on the diagnosis ofinfection in pigs and novel genotyping methods. The Veterinary Journal, 2007, 174(3): 522-529.

[5] LI J N, WANG S N, LI C Y, WANG C L, LIU Y G, WANG G, HE X J, HU L, LIU Y Y, CUI M M, BI C H, SHAO Z Y, WANG X J, XIONG T, CAI X H, HUANG L, WENG C J. Secondaryinfection enhances highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV) infection- mediated inflammatory responses. Veterinary Microbiology, 2017, 204: 35-42.

[6] POMORSKA-MÓL M, DORS A, KWIT K, CZYŻEWSKA-DORS E, PEJSAK Z. Coinfection modulates inflammatory responses, clinical outcome and pathogen load of H1N1 swine influenza virus andinfections in pigs. BMC Veterinary Research, 2017, 13(1): 376.

[7] XIANG J Y, ZENG J, LI X Y, ZHANG Z K, DIN A U, ZHAO K L, ZHOU Y S. High incidence and characteristic of PRRSV and resistant bacterial Co-Infection in pig farms. Microbial Pathogenesis, 2020, 149: 104536.

[8] ZHANG J, WANG J, ZHANG X, ZHAO C P, ZHOU S X, DU C L, TAN Y, ZHANG Y, SHI K Z. Transcriptome profiling identifies immune response genes against porcine reproductive and respiratory syndrome virus andco-infection in the lungs of piglets. Journal of Veterinary Science, 2022, 23(1): e2.

[9] 刘韶娜, 张斌, 相德才, 赵智勇, 赵彦光. 戊糖片球菌368对猪生长性能、粪菌结构和代谢产物的影响. 微生物学通报, 2021, 48(6): 2035-2048.

LIU S N, ZHANG B, XIANG D C, ZHAO Z Y, ZHAO Y G. Effect of368 on grow performance, fecal microbiota and metabolite in pigs. Microbiology China, 2021, 48(6): 2035-2048. (in Chinese)

[10] GALINA PANTOJA L, STAMMEN B, MINTON B, AMODIE D. Serologic profiling ofvaccinated sows and their litters using a novel oligopeptide permease A enzyme-linked immunosorbent assay reveals unexpected patterns of serological response and maternal antibody transfer. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 2014, 26(1): 125-130.

[11] MACEDO N, OLIVEIRA S, TORREMORELL M, ROVIRA A. Immune response to oligopeptide permease A (OppA) protein in pigs naturally and experimentally infected with. Research in Veterinary Science, 2016, 107: 62-67.

[12] MINIATS O P, SMART N L, EWERT E. Vaccination of gnotobiotic primary specific pathogen-free pigs against. Canadian Journal of Veterinary Research, 1991, 55(1): 33-36.

[13] TAKAHASHI K, NAGA S, YAGIHASHI T, IKEHATA T, NAKANO Y, SENNA K, MARUYAMA T, MUROFUSHI J. A cross-protectionexperiment in pigs vaccinated withserovars 2 and 5 bacterins, and evaluation of a bivalent vaccine under laboratory and field conditions. The Journal of Veterinary Medical Science, 2001, 63(5): 487-491.

[14] CHEN S L, CHU Y F, ZHAO P, HE Y, JIAN Y N, LIU Y S, LU Z X. Development of a recombinant OppA-based indirect hemagglutination test for the detection of antibodies against. Acta Tropica, 2015, 148: 8-12.

[15] LIU Y B, DU Y J, SONG Y P, TIAN Y, QI Y, ZHANG Q X, HE Q G, WANG X R, CHEN H C, CAI X W, XU X J. Development and application of an antibody detection ELISA forbased on a monomeric autotransporter passenger domain. BMC Veterinary Research, 2019, 15(1): 436.

[16] GARMORY H S, TITBALL R W. ATP-binding cassette transporters are targets for the development of antibacterial vaccines and therapies. Infection and Immunity, 2004, 72(12): 6757-6763.

[17] TANABE M, ATKINS H S, HARLAND D N, ELVIN S J, STAGG A J, MIRZA O, TITBALL R W, BYRNE B, BROWN K A. The ABC transporter protein OppA provides protection against experimentalinfection. Infection and Immunity, 2006, 74(6): 3687-3691.

[18] YANG M, JOHNSON A, MURPHY T F. Characterization and evaluation of theoligopeptide permease A as a mucosal vaccine antigen. Infection and Immunity, 2011, 79(2): 846-857.

[19] LYMAN L R, PENG E D, SCHMITT M P.iron-regulated surface protein HbpA is involved in the utilization of the hemoglobin-haptoglobin complex as an iron source. Journal of Bacteriology, 2018, 200(7): e00676-e00617.

[20] LYMAN L R, PENG E D, SCHMITT M P. TheHbpA hemoglobin-binding protein contains a domain that is critical for hemoprotein binding, cellular localization, and function. Journal of Bacteriology, 2021, 203(21): e0019621.

[21] SEGAWA T, JOHNSON C M, BERNTSSON R P A, DUNNY G M. Two ABC transport systems carry out peptide uptake in: their roles in growth and in uptake of sex pheromones. Molecular Microbiology, 2021, 116(2): 459-469.

[22] XU X H, CHEN J W, HUANG X X, FENG S H, ZHANG X Y, SHE F F, WEN Y C. The role of a dipeptide transporter in the virulence of human pathogen,. Frontiers in Microbiology, 2021, 12: 633166.

[23] RAFIEE M, BLACKALL P J. Establishment, validation and use of the Kielstein-Rapp-Gabrielson serotyping scheme for. Australian Veterinary Journal, 2000, 78(3): 172-174.

[24] ZHENG F, SHAO Z Q, HAO X N, WU Q Q, LI C L, HOU H F, HU D, WANG C J, PAN X Z. Identification of oligopeptide-binding protein (OppA) and its role in the virulence ofserotype 2. Microbial Pathogenesis, 2018, 118: 322-329.

[25] ATKINSON B M, BEARSON B L, LOVING C L, ZIMMERMAN J J, KICH J D, BEARSON S M D. Detection of-specific antibody in swine oral fluids. Porcine Health Management, 2019, 5: 29.

[26] 王芳, 冯宇, 张阁, 蒋卉, 朱良全, 丁家波. 牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法的建立. 中国农业科学, 2016, 49(9): 1818-1825. doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.09.018.

WANG F, FENG Y, ZHANG G, JIANG H, ZHU L Q, DING J B. Development of indirect ELISA for antibody of. Scientia Agricultura Sinica, 2016, 49(9): 1818-1825. doi:10.3864/ j.issn.0578-1752.2016.09.018. (in Chinese)

[27] CHANG C Y, PENG J Y, CHENG Y H, CHANG Y C, WU Y T, TSAI P S, CHIOU H Y, JENG C R, CHANG H W. Development and comparison of enzyme-linked immunosorbent assays based on recombinant trimeric full-length and truncated spike proteins for detecting antibodies against porcine epidemic diarrhea virus. BMC Veterinary Research, 2019, 15: 421.

[28] 刘俊琦. 副猪嗜血杆菌Neu-ELISA方法的构建及应用. 湖南畜牧兽医,2020(05):43-46.

Liu J q. Construction and application ofNEU-ELISA method. Hunan Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2020(05):43-46. (in Chinese)

[29] LI M, CAI R J, SONG S, JIANG Z Y, LI Y, GOU H C, CHU P P, LI C L, QIU H J. Evaluation of immunogenicity and protective efficacy of recombinant outer membrane proteins of Haemophilus parasuis serovar 5 in a murine model. PLoS ONE, 2017, 12(4): e0176537.

[30] WEIßE C, DITTMAR D, JAKÓBCZAK B, FLORIAN V, SCHÜTZE N, ALBER G, KLOSE K, MICHALIK S, VALENTIN-WEIGAND P, VÖLKER U, BAUMS C G. Immunogenicity and protective efficacy of a Streptococcus suis vaccine composed of six conserved immunogens. Veterinary Research, 2021, 52(1): 112.

[31] LUCERO N E, FOGLIA L, AYALA S M, GALL D, NIELSEN K. Competitive enzyme immunoassay for diagnosis of human brucellosis. Journal of Clinical Microbiology, 1999, 37(10): 3245-3248.

[32] LI J, CAO Y Y, WANG M S, CHENG A C, OU X M, MAO S, SUN D, LIU M F, ZHANG S Q, ZHAO X X, JIA R Y, YANG Q, WU Y, ZHU D K, CHEN S, HUANG J, GAO Q, TIAN B. Development of an indirect ELISA method based on the VP4 protein for detection antibody against duck hepatitis A virus type 1. Journal of Virological Methods, 2022, 300: 114393.

[33] XU W H, SUDERMAN M, KOZIUK J, OJKIC D, BERHANE Y. Development of A recombinant nucleocapsid based indirect ELISA for the detection of antibodies to avian metapneumovirus subtypes, A, B, and C. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2021, 231: 110151.

[34] 田杨, 刘云宝, 马辉, 潘其聪, 肖静, 陈焕春, 蔡旭旺, 徐晓娟. 副猪嗜血杆菌Apd-ELISA抗体检测试剂盒的制备和初步应用. 畜牧兽医学报, 2020, 51(9): 2227-2237.

TIAN Y, LIU Y B, MA H, PAN Q C, XIAO J, CHEN H C, CAI X W, XU X J. Development and preliminary application of apd-ELISA kit for antibody detection ofChinese Journal of Animal and Veterinary Sciences, 2020, 51(9): 2227-2237. (in Chinese)

[35] GAO Z, SHAO J J, ZHANG G L, GE S D, CHANG Y Y, XIAO L, CHANG H Y. Development of an indirect ELISA to specifically detect antibodies against African swine fever virus: bioinformatics approaches. Virology Journal, 2021, 18(1): 97.

[36] NI H B, GONG Q L, ZHAO Q, LI X Y, ZHANG X X. Prevalence of“” in pigs in China: a systematic review and meta-analysis. Preventive Veterinary Medicine, 2020, 182: 105083.

Development and Application of Indirect ELISA Kits for Antibody Detection of

College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095

【Background】(HPS) is the pathogen of upper respiratory tract of pigs, causing Glaser’s disease, mainly in pigs before and after weaning and in the nursery stage, which is usually seen in young pigs aged 5-8 weeks, and the incidence rate is generally 10%-15%. There are 15 serotypes of the bacteria and the serotypes currently prevalent in major pig-raising countries are 4, 5, 12 and 13, and it is one of the main bacterial pathogens affecting the development of pig industry. At present, there is no commercial kit for detecting antibody of the bacteria in China.【Objective】The development of a rapid, sensitive and specific antibody detection kit could provide the technical support for the effective prevention and control of the disease.【Method】Three different periplasmic substrate binding proteins of OppA, DppA and HbpA were expressed and purified. The positive and negative serum was used to screen one of the above three proteins with sound immunoreactivity and specificity. Using the screened protein as the coating antigen, an indirect ELISA method for detecting HPS antibody was established, the reaction conditions of indirect ELISA were optimized, and the kit was assembled. On this basis, the sensitivity and specificity of the kit were evaluated; the practicability of the kit was evaluated by testing 2 000 clinical pig serum samples collected at different times and from different pig farms; based on the above clinical serum samples, 200 samples were selected randomly and tested with this kit, indirect hemagglutination test, and imported commercial kit, respectively, and the test results were compared to verify the compliance rate of the kit; finally, the kit developed in this study was used to detect immune and challenge pigs. The collected serum was used to evaluate the growth and decline of antibodies against the bacteria after immunization.【Result】Three proteins of OppA, DppA and HbpA were successfully expressed and purified, and it was found that OppA had the best immunoreactivity and specificity. After optimizing the reaction conditions, the coating concentration of OppA was determined to be 1 μg·ml-1, the blocking solution was 0.5% BSA-PBS solution, the sample dilution was 1% BSA-PBST solution, the sample incubation time was 30 min, the sample dilution was 1:50, the enzyme labeled secondary antibody incubation time was 30min, the substrate action time was 15min, and the cut-off value was 0.18; the sensitivity and specificity of the kit were 96.67%, and the kit could detect the HPS positive sera against HPS with common serotypes prevalent in China and no cross-reaction with positive sera of other common pathogens in pigs; the positive rate of 2 000 clinical serum samples was 34.65%; 200 serum samples were randomly selected, the coincidence rate with indirect hemagglutination test was 92.50%, and the coincidence rate with imported commercial kit was 87.00%; using the kit to detect the swine serum collected at different times after immunization and challenge, the HPS antibody fluctuation rule was in line with expectations.【Conclusion】The ELISA antibody detection kit fordeveloped in this study had high specificity and sensitivity, and hads a high coincidence rate with the commercial kit and indirect hemagglutination test, so it could be used for clinical HPS antibody detection and vaccine immunity evaluation.

; ABC transporter periplasmic substrate binding proteins; indirect ELISA; immunization evaluation

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.08.015

2021-12-13；

2022-04-24

江苏省农业科技自主创新资金项目（CX(19)2020）、南京农业大学大学生创新训练项目（202117XX07，202117XX22）、江苏高校优势学科建设工程专项资金项目（PAPD）

张鹏云，E-mail：zzppyy1991@163.com。通信作者范红结，Tel：025-84399592；E-mail：fhj@njau.edu.cn

（责任编辑 林鉴非）