转基因玉米MON87427梯度含量基体标准物质的研制

李俊，单露英，肖芳，李允静，高鸿飞，翟杉杉，吴刚，张秀杰，武玉花

转基因玉米MON87427梯度含量基体标准物质的研制

1中国农业科学院油料作物研究所/农业农村部农业转基因生物溯源重点实验室，武汉 430062；2农业农村部科技发展中心，北京 100025

【目的】转基因检测标准物质是转基因生物安全监管、标识制度实施的物质基础，是实验室内检测数据溯源、实验室间检测数据可比的保证。中国于2017年批准进口转基因玉米MON87427用作加工原料，其安全监管和检测急需研制有证标准物质。【方法】以开发商提供的转基因玉米MON87427杂合种子和非转基因受体种子为原材料，对转基因玉米MON87427和其受体种子分别清洗、干燥、冷冻研磨、粒径及含水量检测，按质量分数（以干基计）称量配制得到质量分数分别为60.0、99.5和1 000.0 mg·g-1的转基因玉米MON87427基体标准物质MON87427a、MON87427b和MON87427c。运用实时荧光定量PCR进行粉末的均匀性初检，初检合格后分装。用MON87427/二重微滴数字PCR（ddPCR）方法进行标准物质均匀性、稳定性评估和8家实验室联合定值。根据《标准物质定值的通用原则及统计学原理》（JJF 1343）进行标准物质均匀性评估、稳定性评估、联合定值数据的处理及不确定度评定。【结果】本批标准物质有MON87427a、MON87427b、MON87427c 3个浓度，粒径小于200 μm的粉末大于80%，含水量低于5%。用棕色玻璃瓶分装，不低于1.0 g/瓶，充氮后轧盖，3个浓度的标准物质各分装400瓶。3种标准物质均匀性检验的值均小于临界值0.05(14,30)（2.04），在瓶内和瓶间具有良好的均匀性，使用时，最小取样量为100 mg。标准物质在25℃、37℃和60℃条件下可稳定储存14 d，表明在常温下运输14 d标准物质特性量值不发生趋势性变化；在4℃和-20℃条件下长期稳定性达到12个月；开盖取样5次，标准物质特性量值未发生显著偏离。8家实验室联合测定的标准物质拷贝数比值无异常值、呈正态分布、且等精度，标准物质MON87427a、MON87427b、MON87427c的标准值及扩展不确定度分别为（2.92±0.44）%、（4.89±0.57）%、（52.1±3.4）%。【结论】研制的转基因玉米MON87427梯度含量基体标准物质均匀性良好，可稳定运输和储存，满足转基因玉米MON87427定性、定量检测需求，为转基因玉米MON87427的安全监管、定量标识制度的实施提供了可靠的有证标准物质。

转基因玉米MON87427；基体标准物质；二重微滴数字PCR；特性量值；不确定度

0 引言

【研究意义】标准物质和文本标准共同构成完整的标准体系。标准物质是文本标准实施的物质基础，是确保检测结果准确、可靠、可比、可溯源的前提[1]。研制转基因检测标准物质是实施转基因检测标准、落实定量标识制度、保障转基因生物安全、贯彻党中央“尊重科学、严格监管，有序推进生物育种产业化应用”指示精神的迫切需要。【前人研究进展】1996年批准首个转基因作物商业化后，转基因作物在世界范围内被广泛种植和应用，为了保护消费者的知情权，绝大多数国家实施转基因产品标识制度。转基因生物安全管理和标识制度的实施需要有转基因检测标准物质和检测标准[2]。欧盟委员会联合研究中心（Joint Research Center，JRC）下属的标准物质和测量研究所（Institute of Reference Materials and Measurement，IRMM）率先在欧盟委员会资助下研制转基因标准物质，于2004年与英国政府化学家实验室（Laboratory of the Government Chemist，LGC）、德国联邦材料研究和测试研究所（Bundesanstalt für Materialforschung und-prüfung，BAM）合作推出欧洲标准物质（European Reference Materials，ERM）系列转基因标准物质。2016年联合研究中心重组，IRMM更名为F局“健康、消费者和标准物质”（Directorate F-"Health, Consumers and Reference Materials"），继续从事转基因标准物质的研制和生产。欧盟发布的转基因标准物质主要有基体标准物质和质粒标准物质2种类型。一组转基因基体标准物质通常由标称转基因质量分数为0、0.1%、1%、10%和100%（m/m）的有证标准物质组成[3]。但转基因土豆或转基因甘蔗标准物质通常只有0和100% 2个质量分数[4-5]。到2022年，欧盟发布了147种转基因检测基体标准物质，涵盖了欧盟批准的35个转基因品种；研发的质粒标准物质只有转基因大豆356043、转基因玉米MON810、NK603、98140[6]。在美国，转基因检测标准物质由油脂化学家学会（American Oil Chemists’ Society，AOCS）研制和发布。AOCS发布的转基因标准物质主要为纯品粉末或纯品基因组DNA，以纯度赋值，量值不确定度忽略。目前共发布了66个标准物质，包括21个基因组DNA标准物质和45个粉末标准物质，涵盖转基因油菜、棉花、玉米、马铃薯、水稻、大豆和甜菜7个作物[7]。AOCS生产销售的转基因标准物质没有提供标准值的不确定度，原则上达不到量值溯源的要求，不属于有证标准物质。除了欧盟和美国，日本研发了一些质粒标准物质，用作PCR反应的阳性对照。中国已批准64个转基因作物品种进口到中国用作加工原料，包括22个转基因玉米、20个转基因大豆、11个转基因棉花、9个转基因油菜、1个转基因甜菜和1个转基因番木瓜。在转基因重大专项的资助下，中国也自主研发了大量转基因产品，目前已有转基因水稻华恢1号、转基因玉米瑞丰12-5、DBN9936、DBN9858、DBN9501、转植酸酶玉米、转基因大豆DBN9004、中黄6106、SHZD3201等多个转基因品种获得生物安全证书，即将开启商业化应用。为转基因生物安全监管，农业农村部发布了124项现行有效转基因成分检测标准。与发布的检测标准相比，目前，中国仅发布了47个有证标准物质，包括34个基体标准物质、5个基因组DNA标准物质、8个质粒标准物质，涵盖转基因水稻Bt63、TT51-1、克螟稻、科丰6、G6H1，转基因玉米NK603、MON87427、双抗12-5、T25、MIR604、MON863、Bt11，转基因大豆MON89788、MON87751、GTS40-3-2等转基因品种[8-13]。【本研究切入点】与发布的检测标准相比，现行有证标准物质仅能配套少量定性定量检测标准，有证标准物质存在巨大的缺口，不能有效支撑中国定量标识制度的落地实施。前期发布的转化体标准物质大部分只有一个浓度，仅能满足荧光定量PCR的校准需求。而在定量检测过程中，不仅需要校准品，还需要进行测量偏倚控制的质控品，而且校准品和质控品不能为同一个标准物质[14-16]。急需研制转基因产品的梯度含量标准物质，同时满足定量检测的校准和偏倚控制需求。中国于2017年批准转基因玉米MON87427的进口，同年发布了《耐除草剂玉米MON87427及其衍生品种定性PCR方法》标准[17]，为转基因玉米MON87427的安全监管提供了标准化方法。但转基因玉米MON87427的安全监管及标准化方法的应用需要有准确量值的标准物质。【拟解决的关键问题】本研究拟研制转基因玉米MON87427梯度含量基体标准物质，将进一步完善转基因玉米基体标准物质制备的技术平台，为转基因玉米MON87427的定量检测提供有准确量值的校准品和阳性定量质控品，保证各实验室间检测数据的准确性和可比性，为转基因定量标识制度的实施提供物质保障。

1 材料与方法

1.1 试验材料

标准物质原材料用孟山都公司提供的转基因玉米MON87427杂合种子和对应受体非转基因玉米种子。

1.2 DNA提取

用植物基因组DNA提取试剂盒DNeasy Plant Mini Kit（Qiagen公司，德国）提取玉米种子粉末的基因组DNA，粉末用量100—200 mg。提取的基因组DNA用90 μL 0.1×TE（Tris-EDTA）缓冲液溶解。用紫外分光光度法（Nanodrop 1000，Nanodrop，美国）检测基因组DNA溶液的浓度，并根据OD260/280的比值评估基因组DNA的质量。2020年，在农业农村部科技发展中心实验室提取原材料基因组DNA；2021年，在中国农业科学院油料作物研究所实验室提取标准物质基因组DNA。

1.3 原材料鉴定

2020年，在农业农村部科技发展中心实验室进行原材料鉴定。采用四分法抽取转基因玉米MON87427种子300粒，单粒种子提取基因组DNA；抽取非转基因玉米3 000粒种子，混合研磨，提取基因组DNA。以提取的基因组DNA为模板，用转化体特异性和插入位点特异性普通PCR方法进行基因型鉴定；用MON87427转化体特异性和内标基因荧光PCR方法[18-19]，进行纯度鉴定。实时荧光定量PCR方法的引物、探针序列见表1。反应体系为10 μL 2×TaqMan Universal PCR Master Mix（Bio-rad）、0.8 μL上下游引物（10 μmol·L-1）、0.4 μL探针（10 μmol·L-1）、2.0 μL基因组DNA，加ddH2O至20 μL。在CFX96荧光定量PCR仪（Bio-rad）上进行反应，反应程序为95℃ 3 min；95℃ 10 s，60℃ 60 s，45个循环。用软件CFX Manager ™ ver. 1.6（1.6.541.1028）读取数据。普通PCR反应体系为12.5 μL 2×reaction Mix、1.0 μL上下游引物（10 μmol·L-1）、0.3 μL Golden DNA Polymerase（2.5 U·µL-1）、2.0 μL基因组DNA，加8.2 μL ddH2O至25 μL。在C1000 PCR仪（Bio-rad）上进行反应，反应程序为94℃ 3 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 40 s，35个循环；72℃ 5 min。对PCR产品进行凝胶电泳，在凝胶成像系统（JY04S-3C，JUNYI）上成像检测。

表1 PCR引物、探针序列及扩增片段大小

1.4 标准物质制备

2020年，在农业农村部科技发展中心实验室进行标准物质制备。干燥后的转基因和非转基因玉米种子用冷冻研磨系统（SPEX 6870）进行研磨，研磨程序为预冷2 min，研磨3 min，冷却2 min，3个循环。研磨后将种子粉末用震动分筛机（8411型，浙江省上虞市公路仪器厂）过筛，用校准天平称量不同粒径粉末的质量，检测粉末粒度大小分布。转基因粉末和非转基因粉末用真空冷冻干燥系统（Labconco Freezone）干燥48 h。从转基因粉末和非转基因粉末中分别取5份样品，每份2 g，进行粉末含水量测定（DSH-50A-1，上海佑科仪器仪表有限公司）。将含水量和原材料候选物纯度等因素考虑在内，计算配比干基转基因粉末质量分数为60和100 mg·g-1的混合粉末应称取的转基因粉末和非转基因粉末的质量。根据计算结果，使用校准的感量为1 mg的精密分析天平，准确称量转基因玉米MON87427种子粉末和非转基因玉米种子粉末。将称量的2种粉末混在一起，利用固体粉末混合仪（科勒，YG-2L）混合24 h以上，充分混匀，混合样品分别命名为MON87427a和MON87427b。将转基因粉末直接分装，制备MON87427c。

1.5 均匀性初检

2020年，在农业农村部科技发展中心实验室进行标准物质均匀性初检。在转基因玉米粉末和非转基因玉米粉末混匀过程中取样进行均匀性初检，在混匀12、18和24 h各取样一次。每次取样选不同的部位取样9份，每份100 mg。提取基因组DNA后，用MON87427转化体和玉米内标基因荧光定量PCR方法进行检测[18-19]，MON87427转化体和玉米内标基因的荧光定量PCR反应体系相同，反应体系和程序见1.3，引物/探针序列见表1。依据《标准物质定值的通用原则及统计学原理》（JJF1343）[20]，对均匀性初检数据进行单因素方差分析，计算统计量，并与临界值比较，判断标准物质的均匀性。

1.6 均匀性检验

2020年，在中国农业科学院油料作物研究所实验室进行标准物质均匀性检验。每种标准物质随机抽取15瓶，每瓶取3个子样，每个子样100 mg，每种标准物质取45个子样。提取各子样的基因组DNA，用MON87427/二重微滴数字PCR（ddPCR）检验标准物质的均匀性。MON87427/二重ddPCR已在前期研究中优化确认[21]，引物和探针见表1。20 μL反应体系为10 μL 2×ddPCR supermix、0.8 μL上游引物（10 μmol·L-1）、0.8 μL下游引物（10 μmol·L-1）、0.4 μL探针（10 μmol·L-1）、1 μL DNA模板和5 μL ddH2O，MON87427转化体和内标基因引物/探针浓度相同。反应程序为95℃ 10 min；94℃ 30 s，58.4℃ 1 min，50个循环；98℃ 10 min，升降温速度2℃·s-1；4℃保存，降温速度1℃·s-1。反应结束后，将96孔板平缓地放入微滴读取仪（QX200 droplet reader，Bio-rad）中收集微滴信号，采用QuantaSoft Version 1.7.4.0917软件读取数据。数据分析依据及方法同均匀性初检。

1.7 稳定性检验

2020—2021年，在中国农业科学院油料作物研究所实验室进行标准物质稳定性检验。稳定性检验包括短期稳定性（运输稳定性）、长期稳定性、开盖稳定性检验，均用建立的MON87427/二重ddPCR进行检验，二重ddPCR反应体系和程序见1.5。短期稳定性检验设置3个温度25℃、37℃和60℃，标准物质在每个温度分别放置0、3、7和14 d，3个温度下在每个时间点取样1瓶。长期稳定性检验设置2个温度4℃和-20℃，标准物质在每个温度分别放置0、1、2、4、6和12个月，每个温度点和时间点各取样1瓶。开盖稳定性检验每个浓度取2瓶标准物质，设5个不同的开盖时间点，每次开盖从每瓶标准物质中取2个子样，每个子样100 mg，共进行5次开盖操作。取出的样品统一放置在-20℃冰箱中，待所有样品取出后，采用同步稳定性评估方案在重复条件下进行检测，每瓶样品提取3份基因组DNA进行检验。依据《标准物质定值的通用原则及统计学原理》（JJF 1343）[20]，对短期稳定性和长期稳定性检验数据绘制特性值随时间变化曲线的线性模型（=0+1），根据拟合曲线的斜率是否显著，判断特性值在储存周期内是否稳定。对开盖稳定性检验数据进行检验，考察第一次开盖检测数据与后续开盖检测数据间是否存在显著差异。

1.8 标准物质联合定值

2021年，组织8家有资质的实验室利用MON87427/二重ddPCR方法对标准物质的特性量值进行联合测定。每家实验室分发每个浓度标准物质2瓶，每瓶标准物质重复检测4次。检测完成后，将数据反馈给组织方汇总。依据《标准物质定值的通用原则及统计学原理》（JJF 1343）[20]，对联合定值数据处理，先后进行实验室内异常值检验、数据正态分布检验、实验室间异常值和等精度检验。

1.9 数据处理及不确定度评定

2 结果

2.1 标准物质制备

对标准物质原材料转基因玉米MON87427种子和对应非转基因玉米种子进行纯合度和纯度鉴定。结果表明，转基因玉米MON87427籽粒均为杂合种子；抽300粒种子进行单粒检测，MON87427转化体PCR均为阳性，在95%的置信度下其纯度≥99.01%；抽取3 000粒非转基因玉米种子进行混合检测，MON87427转化体PCR为阴性，在95%的置信度下其纯度≥99.9%。

2.1.1 粉末粒度和含水量检测 对转基因玉米MON87427籽粒和非转基因玉米籽粒冷冻研磨后，检测转基因和非转基因粉末的粒径分布，转基因玉米粉末颗粒度小于200 μm的颗粒占81.73%，对应非转基因玉米粉末颗粒度小于200 μm的颗粒占81.79%。2种原材料粒径小于200 μm的粉末均占80%以上，颗粒度相似，且与欧盟制备的粉末标准物质的粒度相近[3]，满足高效提取基因组DNA的要求。将粉末冷冻干燥后，分别测定转基因粉末和非转基因粉末含水量。转基因玉米MON87427粉末含水量（1.08±0.25）%，非转基因玉米粉末含水量（1.10±0.34）%，二者含水量相近，且低于标准规定的10%[22]。

2.1.2 配比混合 拟制备3种不同转基因含量的基体标准物质，分别为MON87427a、MON87427b和MON87427c，对应的转基因粉末质量分数依次为60、100和1 000 mg·g-1。标准物质MON87427a和MON87427b需通过混合转基因粉末和非转基因粉末配制，MON87427c通过直接分装转基因玉米MON87427粉末制备。MON87427a和MON87427b均配制总重量为450 g的混合粉末，将转基因粉末和非转基因粉末含水量考虑在内，计算需称取的转基因粉末和非转基因粉末质量（表2）。使用校准的感量为1 mg的精密分析天平实际称量27.005 g转基因粉末和422.997 g非转基因粉末，充分混合，制备质量分数为60.02 mg·g-1的标准物质MON87427a；称取44.778 g转基因粉末和405.222 g非转基因粉末，充分混合，制备质量分数为99.52 mg·g-1的标准物质MON87427b9（表2）。

2.1.3 均匀性初检 在混匀过程中对标准物质取样进行均匀性初检。用实时荧光定量PCR检测每份样品中MON87427转化体与内标基因的拷贝数比值。对所有抽取样品的测试数据进行单因素方差分析，计算不同时间点抽取样品的统计量值（表3）。结果表明，3个浓度梯度标准物质在混合12、18和24 h后，其统计量值均小于临界值0.05(8,18)（2.51），表明标准物质在混合12 h后，从不同位置抽取的样品，其特性值无显著差异，粉末混合均匀，可进行分装。

表2 制备标准物质MON87427a和MON87427b称取的转基因粉末和非转基因粉末质量

表3 MON87427标准物质的均匀性初检结果

2.1.4 分装 用电子天平称取不少于1.0 g的粉末置于棕色玻璃瓶中，充氮气、加塞，压盖。MON87427a、MON87427b、MON87427c 3种标准物质分别分装400瓶。

2.2 均匀性评估

从每种标准物质中随机选取15瓶，每瓶取3份子样提取DNA。采用MON87427/二重ddPCR方法检测每份样品中MON87427/的拷贝数比值。对检测数据进行检验，计算3种标准物质的统计量。标准物质MON87427a的统计量为1.70、MON87427b的统计量为1.40、MON87427c的统计量为1.63（表4）。3种标准物质的统计量都小于临界值0.05（14,30）（2.04），表明制备的3种标准物质的特性值在瓶内和瓶间无显著差异，均匀性良好。

表4 MON87427标准物质的均匀性方差分析结果

根据发布的转基因产品DNA提取和纯化标准[23-24]，提取DNA的最小取样量不少于100 mg。以100 mg MON87427标准物质粉末作为原料提取基因组DNA，获取的基因组DNA足够后续绘制标准曲线或用作质控对照。取样100 mg粉末进行标准物质的均匀性评估，MON87427a、MON87427b、MON87427c 3个基体标准物质均显示良好的均匀性，且均匀性评估测量程序的重复性标准偏差均小于标准物质物质标准不确定度的1/3。100 mg取样量能获得可接受精密度的测量结果，因此，本批标准物质的最少取样量为100 mg。

2.3 稳定性评估

基体标准物质的运输温度在冬季通常会超过20℃，夏季超过30℃，在太阳照射下甚至会达到60℃。在短期稳定性评估中，设定标准物质的储存温度为25℃、37℃和60℃。计算25℃、37℃和60℃条件下，各标准物质MON87427/的拷贝数比值随储存时间变化曲线（=0+1）的斜率1，及斜率1的标准偏差(1)（表5）。-检验（自由度=-2）结果显示各回归曲线的斜率不显著，即|1|<0.95n-2·(1)。检验结果表明，3个基体标准物质在25℃、37℃和60℃条件下储存，特性值未随储存时间的延长表现出明显的趋势性变化。因此，3个基体标准物质可在常温（25℃—37℃）乃至极端高温60℃条件下稳定运输14 d。

表5 MON87427标准物质的短期稳定性评估结果

基体标准物质通常在冰箱冷藏或冷冻条件下长期储存，在长期稳定性评估中，设定标准物质的储存温度为4℃和-20℃。绘制4℃和-20℃条件下，标准物质特性值随储存时间的变化曲线（图1）。3个浓度的基体标准物质在不同的温度下储存12个月，特性量值未随着储存时间的延长发生单方向变化。-检验表明各回归曲线的斜率1不显著，3个浓度的基体标准物质在4℃和-20℃条件下均可稳定储存12个月以上，特性量值不发生显著变化。

标准物质在使用过程中存在多次使用多次开盖的问题，开盖操作会令标准物质粉末吸潮，可能影响标准物质的稳定性，故对本批标准物质进行了开盖稳定性检测。采用检验法分别比较第2—5次开盖样品的拷贝数比值测量值与第一次开盖样品拷贝数比值测量值间的一致性。计算的值均小于临界值(0.05,6)，结果表明，第2—5次开盖操作并未导致标准物质的拷贝数比值测量值显著偏离第一次开盖标准物质的测量值（表6）。因此，本批标准物质在使用过程中可开盖5次。

2.4 联合定值及数据处理

8家实验室均按统一的定值程序在规定时间内完成了标准物质的定值，并反馈了盖章的定值结果。用狄克逊法和格拉布斯法分别检验8家实验室3个浓度标准物质的定值数据，未发现实验室内异常数据；用达戈斯提诺法对联合定值数据进行正态性分布检验，当置信概率为95%时，统计值均落在达戈斯提诺法检验临界区间，接受8家实验室对3个浓度标准物质的联合定值数据为正态分布；用狄克逊准则对3个标准物质的8家实验室定值数据平均值进行统计检验，未发现异常平均值；采用科克伦法检验3个标准物质的8家实验室间定值数据平均值是否等精度，统计量值均小于临界值(0.05,8,8)，表明8家实验室定值数据平均值间为等精度。联合定值的数据实验室内和实验室间均无异常值，实验室间数据等精度，且定值数据呈正态分布，定值数据符合标准JJF 1343的要求。计算定值数据的总平均值，作为标准物质特性量值拷贝数比值的标准值（表7）。

图1 标准物质MON87427a、MON87427b、MON87427c在4℃和-20℃放置不同时间转基因含量的变化趋势

表6 MON87427标准物质开盖稳定性评估结果

表7 MON87427标准物质联合定值结果统计分析

2.5 不确定度评定

标准物质的不确定度主要来源于均匀性引起的不确定度、稳定性引起的不确定度和定值过程带来的不确定度。根据标准物质的均匀性评估和稳定性评估数据，分别评定均匀性相对不确定度（rel,bb）、短期稳定性相对不确定度（rel,ss）、长期稳定性相对不确定度（rel,ls）（表8）。

标准物质定值过程引入的不确定度c包括A类不确定度和B类不确定度2个部分。A类不确定度统计为8家实验室定值数据总平均值的标准差，相对不确定度为相对标准差（表7）；B类不确定度通过对影响数字PCR测量准确性关键因素的分析，以非统计分析的方法进行评定。本批标准物质采用MON87427/二重ddPCR方法进行联合定值，根据标准ISO 20395:2019（E）[22]，二重ddPCR测量的拷贝数比值的B类不确定度主要来源于数字PCR阈值线设定产生的不确定度。根据Deprez等[25]提供的方法，用MON87427/二重ddPCR动力学范围测试的数据[21]，评定阳性微滴识别引入的不确定度。MON87427转化体ddPCR阳性微滴识别引入的相对不确定度为0.687%，内标基因ddPCR阳性微滴识别引入的相对不确定度为0.542%，将二者合成为B类相对不确定度。将A类相对不确定度和B类相对不确定度合成为标准物质定值过程引入的相对不确定度rel,c（表8）。

表8 MON87427基体标准物质量值和不确定度

将均匀性相对不确定度（rel,bb）、短期稳定性相对不确定度（rel,ss）、长期稳定性相对不确定度（rel,ls）和定值相对不确定度（rel,c）4个分量合成标准物质的相对不确定度（rel,CRM）。在95%置信度下，取包含因子k=2，计算3个浓度标准物质标准值的扩展不确定度（表8）。3个浓度标准物质MON87427a、MON87427b、MON87427c的标准值及扩展不确定度依次表示为（2.92±0.44）%、（4.89± 0.57）%、（52.1±3.4）%。

3 讨论

3.1 标准物质满足定量检测校准和质控的需求

中国即将推进生物育种产业化，急需出台并实施转基因产品的定量标识制度，设定定量标识阈值，对发生无意或低水平转基因成分混杂的农产品、食品及饲料等豁免标识，在保障公众知情权的前提下，降低标识成本，提升生物育种产业的经济社会效益。转基因检测标准物质是进行定量标识和安全监管的物质基础，立足中国的转基因生物安全监管和标识需求，前期已研制了一批转基因检测有证标准物质。本着先易后难的原则，前期研制的主要是纯品标准物质，包括转基因玉米T25、MIR604、转基因大豆MON89788、转基因水稻科丰6号、克螟稻等，一个转基因品种对应一种标准物质，能够满足转基因产品定量检测的校准需求[9-13]。但在转基因定量检测中，还需要转基因含量与标识阈值相当的标准物质作为质控品，对检测过程中的定量偏倚进行有效控制[14-15]。本研究在研制MON87427转化体纯品标准物质的基础上，还研制了低浓度的标准物质，建立了梯度含量基体标准物质的研制程序，流程图详见图2。

研制的本批标准物质充分考虑了定量检测的实际需求，在研制纯品标准物质MON87427c的基础上，又研制了拷贝数比值标准值为2.92%和4.89%的低浓度标准物质MON87427a和MON87427b。中国还未正式出台定量标识制度，定量标识阈值设定为3%还是5%尚未最终确定。无论将标识阈值设定为3%还是5%，都可用本批低浓度标准物质MON87427a或MON87427b作为定量检测的质控对照，用纯品标准物质MON87427c作为定量检测的校准品绘制标准曲线。

图2 质量分数标准物质研制流程图

3.2 二重数字PCR提高了标准物质的定值准确性

特性量值准确、均匀、稳定是标准物质的基本特征。标准物质的均匀性评估、稳定性评估及定值都依赖于被确认的精准定量方法。数字PCR是一种不依赖于标准物质的核酸拷贝数绝对测量技术，已成为转基因检测标准物质定值的参考方法，并广泛应用于标准物质的定值[26-27]。在同一反应体系中同步检测外源基因和内标基因的二重ddPCR技术消除了外源基因和内标基因的取样差异，被证明比单重数字PCR技术具有更高的定量准确性[28]。转基因产品定量结果表示为外源基因和内标基因的拷贝数比值，根据标准ISO 20395:2019（E）[14]，二重ddPCR测量的外源基因和内标基因的拷贝数比值不受微滴体积和DNA模板稀释倍数的影响，从而减少了定值结果的2个不确定度分量。与单重数字PCR相比，本批标准物质用MON87427/二重数字PCR进行标准物质的定值，定值结果具有更高的准确性和更小的定值不确定度。

4 结论

本批转基因玉米MON87427基体标准物质有3个浓度，分别为MON87427a、MON87427b和MON87427c，标准值及扩展不确定度依次为（2.92±0.44）%、（4.89± 0.57）%、（52.1±3.4）%。3个浓度的标准物质均具有良好的均匀性和稳定性，特性量值准确可靠，满足检测机构对转基因玉米MON87427进行定性、定量检测的需求，为定量检测校准和质控提供了可靠的有证标准物质，可有效保障各实验室检测数据的准确性、可靠性和可比性。

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Development of aset of matrix reference materials in different mass fractions of genetically modified maize MON87427

1Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of agricultural genetically modified organism traceability, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Wuhan 430062;2Development Center of Science and Technology, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100025

【Objective】The GMO (genetically modified organism) reference materials (RMs) are the material basis for GMO safety supervision and labeling policy implementation. During GMO detection the utilization of RMs guarantees the traceability of quantitative results within laboratory and the comparability of quantitative results between laboratories. GM (genetically modified) maize MON87427 has been approved to be imported as raw material in China, it’s urgent to develop certified reference materials (CRMs) for safety supervision and quantification. 【Method】The GM maize MON87427 hybrid seeds and non-GM counterparts provided by the developer were used as raw materials to perform washing, drying, freeze-grinding, particle size measurement, and moisture content measurement, sequentially. The matrix RMs of MON87427a, MON87427b and MON87427c were produced by blending the seed powder of the GM maize MON87427 and a non-GM counterpart in GMO mass fractions of 60.0 mg·g-1, 99.5 mg·g-1and 1 000.0 mg·g-1on a dry basis. The real-time quantitative PCR was used to conduct an initial assessment of homogeneity before packing. The MON87427/duplex digital PCR (ddPCR) was used to evaluate the homogeneity and stability of the RMs as well as the collaborative characterization by 8 qualified laboratories. The data processing of homogeneity, stability, collaborative characterization together with uncertainty evaluation of RMs were carried out according to the standard "General and Statistical Principles for Characterization of Reference Materials" (JJF 1343). 【Result】This batch of RMs contains three RMs of MON87427a, MON87427b, and MON87427c in different mass fractions, with more than 80% of particle size of less than 200 μm and less than 5% of moisture content. The RMs were packed in brown glass bottles, nitrogen flushed before capping, bottling amount was not less than 1.0 g/bottle, a total of 400 bottles were produced for each mass fraction RM. The calculatedvalues of the homogeneity test were all less than the critical value of0.05 (14, 30)(2.04) for the three RMs, displaying good homogeneity within and between bottles, and the minimum intake was determined to be 100 mg. The RMs can be stored stably at 25℃, 37℃, and 60℃ for 14 days, the property value of the RMs does not change significantly after 14 days of transportation at room temperature; the long-term stability can reach 12 months at 4℃ and -20℃; The property value of the samples taken from the same bottle of RM after 5 opening-capping cycles, does not deviate significantly from that of the first taken sample. The collaborative characterization data by eight qualified laboratories displayed normal distribution without outliers and outlying standard deviations. The standard value and expanded uncertainty of MON87427a, MON87427b, Mon87427c were certified to be (2.92±0.44)%, (4.89±0.57)%, (52.1±3.4)%. 【Conclusion】The developed GM maize MON87427 matrix RMs in different mass fractions have good homogeneity, and can be stably transported and stored. This batch of RMs meets the requirements of qualitative and quantitative detection of MON87427 event, providing reliable CRMs for the safety supervision and implementation of quantitative labeling policy for GMO-derived products.

genetically modified maize MON87427; matrix reference material; duplex digital PCR; property value; uncertainty

2022-10-28；

2022-12-08

转基因生物新品种培育重大专项（2016ZX08012-003）

李俊，E-mail：lijuner@caas.cn。通信作者张秀杰，E-mail：zhxj7410@sina.com。通信作者武玉花，E-mail：wuyuhua@oilcrops.cn

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.08.002

（责任编辑 李莉）