ATG5基因单核苷酸多态性与中国西南地区汉族人群肺结核易感性的相关性研究

姜闵慧,周 娟,赵珍珍,周 易△

1.成都华西精准医学产业技术研究院有限公司,四川成都 610000;2.四川大学华西医院实验医学科,四川成都 610041

结核病是严重影响公共卫生的重大传染病,是仅次于新型冠状病毒的第二大“单一感染源”致死原因。其中,肺结核占所有结核病的80%以上。结核分枝杆菌是导致结核病的主要因素,感染结核分枝杆菌的人数约占世界总人口的四分之一[1]。但是由于个体的差异,只有5%～10%发展为活动性肺结核[2]。宿主遗传因素在结核病易感性中起着重要作用[3]。宿主遗传因素对结核病感染人群的免疫反应和表型变异的贡献高达71%[4]。然而,结核分枝杆菌感染机体的发病机制在很大程度上仍然未知,进一步研究结核病感染的有关遗传因素,将有助于了解结核病的发病机制。

自噬是一种细胞内保守的降解过程,在细胞的更新、循环中起着核心作用,以维持细胞内营养物质和能量的稳态[5]。有研究表明,自噬和自噬相关基因缺失的小鼠更容易感染结核分枝杆菌[6-7]。参与自噬途径的基因变异可能会影响宿主对结核分枝杆菌感染的应答,这提示自噬相关基因多态性可能与结核病易感性有关[8-9]。自噬相关基因-5(ATG5)主要参与自噬小体的双层膜弯曲,对自噬的发生起决定性作用,可调节自噬体的形成。然而,ATG5与肺结核易感性相关研究较少。本研究采用病例对照设计对我国西南地区汉族人群ATG5基因的9个单核苷酸多态性(SNP)进行分型,以探讨ATG5基因多态性与结核病的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 随机纳入2014年1月至2016年2月四川大学华西医院的900例活动性肺结核患者(肺结核组)和1 534例健康对照者(健康对照组)进行研究。健康对照组诊断与纳入标准:(1)未感染过结核病;(2)痰涂片及结核分枝杆菌核酸检测等结果为阴性;(3)体检结果为健康个体;(4)影像学检查结果显示为正常;(5)中国西南地区汉族人群。肺结核组纳入标准:(1)根据我国肺结核病诊断标准[10],具有结核病的相关症状及临床表现,结核分枝杆菌病原学检查(涂片抗酸杆菌检查、结核分枝杆菌培养、菌种鉴定及药敏试验、结核分枝杆菌核酸检测)、病理学、影像学、血清学、结核菌纯蛋白衍生物(PPD)试验、γ干扰素释放试验等方法试验结果为阳性;(2)中国西南地区汉族人群。排除标准:(1)其他呼吸系统疾病,如肺部感染、支气管扩张、慢性阻塞性肺疾病、肺心病、肺癌等;(2)其他感染性疾病,如艾滋病、支原体/衣原体感染、肝炎病毒等;(3)自身免疫性疾病,如系统性红斑狼疮、系统性血管炎等;(4)合并其他基础疾病;(5)使用过免疫抑制剂或增强剂。本研究获得四川大学华西医院临床试验与生物医学伦理专委会批准[审批号:2014年审(198)号)],所有受试者均签署知情同意书,自愿参与研究。本研究的所有数据均来自四川大学华西医院检验科“结核病研究”生物库。

1.2方法 采集受试者5 mL乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血,血液标本均储存于生物资源库中。采用滤柱法进行全血基因组DNA提取(Qiagen,德国),并采用新型多重酶连接反应(iMLDR)基因分型技术对ATG5基因的9个SNP位点(rs10484575、rs11754416、rs9486302、rs2284193、rs117827198、rs633724、rs79454666、rs77441653、rs3804338)进行基因分型。实验过程中以双蒸水为阴性对照,并对标本进行随机分组。同时,对随机选取的10%的样品进行重复基因分型,结果为符合率100%,确保基因分型准确。

2 结 果

2.1研究人群基本特征 肺结核组男542例(60.22%)、女358例(39.78%),平均年龄(42.5±14.5)岁;健康对照组男821例(53.52%)、女713例(46.48%),平均年龄(38.0±14.2)岁。肺结核组男性比例高于健康对照组,平均年龄高于对照组,差异均有统计学意义(P=0.001)。

2.2ATG5基因SNP分布情况 ATG5基因的9个SNP满足Hardy-Weinberg平衡(HWE-P>0.05),9个SNP位点的基本信息及分布情况见表1。

表1 9个SNP基本信息及分布情况

2.3ATG5基因单核苷酸多态性与肺结核易感性的关联分析 肺结核组和健康对照组等位基因分布,经过年龄和性别校正后,ATG5基因的位点rs10484575、rs11754416等位基因和基因型频率分布差异有统计学意义(P=0.011、0.035)。在3种遗传模型中,对于rs10484575位点,在加性模型下显示与肺结核相关,提示AA基因型携带者患肺结核的风险降低;在显性模型下显示与肺结核相关,提示AA+GG基因型患肺结核的风险降低。对于rs11754416位点,在加性模型下显示与结核病相关,提示AA基因型携带者患肺结核的风险降低;在显性模型下显示与肺结核相关,提示AA+GG基因型患肺结核的风险降低。见表2、3。

表2 ATG5基因的9个SNP位点在肺结核组和健康对照组之间的等位基因和基因型分析

2.4ATG5基因多态性的单倍型与肺结核易感性关联性分析 用Haploview 4.2软件对ATG5基因上9个SNP位点进行连锁不平衡分析,r2>80%视为强连锁不平衡,其中rs10484575、rs11754416之间存在强连锁不平衡(r2>96%)。本研究构建了一个由rs10484575和rs11754416组成的LD图(图1),2个SNP形成GG、AA 2种单倍型。构建的两种单倍型模型分布差异有统计学意义(P<0.05)。形成的单倍型GG个体患肺结核的风险增高(OR=1.407),形成的单倍型AA个体患肺结核的风险降低(OR=0.720)。见表4。

表3 ATG5基因的9个SNP位点在肺结核组和健康对照组之间的遗传模型分析

图1 ATG5基因上9个SNP之间连锁不平衡示意图

表4 rs10484575、rs11754416形成的单倍型与结核病的关系

3 讨 论

自噬是一种细胞内分解代谢过程,有助于维持体内平衡,并通过溶酶体降解过程去除病原体[11]。研究表明,自噬是一种关键保护过程,可限制结核分枝杆菌在宿主细胞中生长[12～13],自噬基因IRGM1多态性与结核分枝杆菌的保护性机制有关[14-15]。既往研究中,一些与自噬密切相关的基因(如P2X7、VDR、NOD2、TLR8)已被作为结核病患者的候选检测基因[16]。在东南亚[17]、印度[18]受试者中发现自噬基因CP2X7多态性与肺结核易感性密切相关。自噬与分枝杆菌有复杂的相互作用:它既影响直接抗分枝杆菌宿主防御机制,也影响分枝杆菌感染的炎症反应,在清除结核分枝杆菌中起着关键作用[16]。因此自噬在结核分枝杆菌感染中的作用值得关注。

自噬相关基因ATG5,在细胞自噬与凋亡的发生和发展中起重要的调控作用,被称为细胞自噬和凋亡的转换“开关”[19]。有研究证实,西南地区人群中,PRDM1和ATG5基因间的SNP位点rs548234与原发性肺结核有显著关联,在感染结核杆菌的小鼠模型中,敲除 ATG5后小鼠存活不足 30 d,表明ATG5在抵抗结核杆菌时发挥了关键保护效应[20]。另外也有研究证明,miR-1958 通过作用于ATG5 的3′UTR 区调节自噬,进而抑制结核杆菌的生长;相反,miR-1958 降低可增加 ATG5 表达,调节自噬活性,最终影响结核杆菌的存活[21]。因此本研究推测ATG5基因多态性可能与结核病易感性相关。本研究结果显示,位点rs10484575(位于ATG5基因下游)的携带A等位基因的个体患肺结核的风险潜在性降低;在加性模型、显性模型rs10484575的AA基因型对结核病易感性显著降低。尽管采用了不同的分析方法,但在rs10484575位点上观察到相似的统计学意义,表明SNP rs10484575可能是中国汉族西南地区肺结核感染的一个易感位点。位点rs11754416位于ATG5基因内含子上,SNP rs11754416 A等位基因可能是肺结核感染的保护因素,在加性模型、显性模型下显示出AA基因型对结核病易感性显著降低。同时,2个位点(rs10484575、rs11754416)之间存在强连锁不平衡(r2>96%),构建的2种单倍型模型的分布差异均有统计学意义(P=0.011、0.016),形成的单倍型GG个体患肺结核的风险增高(OR=1.407),形成的单倍型AA个体患肺结核的风险降低(OR=0.720)。这与单个SNP关联分析一致,为这2个SNP对肺结核感染起保护作用提供了依据。

本研究的不足之处在于:纳入的对象样本量相对较大,但纳入研究的人群仅限于中国西南地区汉族,这可能会减少由群体混合引起的选择偏差,但也可能在其他种族人群中得到不同的结果。另外,本研究仅进行了ATG5基因上9个SNP位点与结核病易感性的关联研究,未进一步进行基因与环境、基因与基因之间相互作用的研究。

综上所述,本研究发现ATG5基因的rs10484575携带A等位基因的个体患肺结核的风险降低、rs11754416携带A等位基因的个体患肺结核的风险降低,其余7个位点在中国西南地区汉族人群中与肺结核易感性没有关联性。后续可以进一步分析ATG5基因上多个位点突变对基因表达水平的影响,并在其他人群中进一步研究该基因与肺结核易感性之间的关系。