circPTPRA靶向miR-140-5p调控类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖及迁移的机制研究

张 兵,王孝玉,朱亚辉

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是临床常见的一种系统性自身免疫性疾病,随着疾病的发展病人关节骨与软骨组织逐渐被破坏,甚至致使病人残疾,研究[1-2]发现滑膜成纤维细胞过度增殖及迁移可促进RA的发展。环状RNA(circular RNA,circRNA)是由5′端与3′端以共价键结合形成的一种环状RNA分子,其在RA或滑膜成纤维细胞中表达异常,并可能调控细胞增殖及转移等过程[3-4]。circPTPRA高表达可促进动脉粥样硬化的发生及发展[5]。但circPTPRA与RA的相关研究尚鲜见报道。生物信息学预测显示circPTPRA与miR-140-5p存在结合位点,研究[6]表明miR-140-5p在RA滑膜成纤维细胞中表达下调,其可抑制细胞增殖及炎性因子的分泌。但circPTPRA/miR-140-5p分子轴在RA发生发展过程中的作用机制尚未阐明。因此,本研究主要探讨circPTPRA通过靶向调控miR-140-5p而影响RA滑膜成纤维细胞增殖及转移。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2019年10月至2020年1月期间于本院关节外科行膝关节置换术的26例RA病人为研究对象,所有病人均符合2010ACR/EULAR颁布的类风湿关节炎分类标准,其中男16例,女10例,年龄52～67岁,平均年龄(58.59±7.46)岁,术中切除滑膜组织置于-80 ℃冰箱内保存。选取同期于本院接受关节手术的外伤病人26例为对照,所有病人均为外伤所致且均未患有RA,其中男16例,女10例,年龄45～66岁,平均年龄(57.26±3.25)岁。

1.2 主要试剂 DMEM培养液与胎牛血清购自美国Gibco;MTT、DMSO购自美国Sigma;Lipofectamine2000、Transwell小室购自北京索莱宝;Trizol试剂购自美国Invitrogen;逆转录试剂及qRT-PCR试剂均购自美国Thermo Fisher;si-NC、si-circPTPRA、miR-NC、miR-140-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-140-5p购自广州锐博生物;pcDNA3.1、pcDNA-circPTPRA购自上海吉玛;兔抗人CyclinD1、MMP2、MMP9与二抗购自美国CST。

1.3 方法

1.3.1 原代分离培养RA滑膜成纤维细胞 取出病人的滑膜组织,PBS浸泡后冲洗,剪去滑膜附属的外周组织,将滑膜组织剪接呈小块(2 mm3),PBS洗涤后将组织块转移至细胞培养瓶内,于37 ℃培养箱内培养30 min,向培养瓶中加入含有10%胎牛血清的DMEM培养液3 mL,继续培养,用倒置显微镜下观察细胞生长情况,待细胞汇合度达到90%时进行传代培养,选用第3～4代细胞进行后续实验[7]。

1.3.2 实验分组 RA滑膜成纤维细胞按照每孔1×105个细胞的密度接种于6孔板,用不含胎牛血清的培养液分别稀释si-NC、si-circPTPRA、miR-NC、miR-140-5p mimics、anti-miR-NC与si-circPTPRA、anti-miR-140-5p与si-circPTPRA室温孵育5 min(A液),用不含胎牛血清的培养液稀释Lipofectamine2000转染试剂(B液),A液与B液充分混匀后按照每孔400 μL的密度加入6孔板中,分别记为si-NC组、si-circPTPRA组、miR-NC组、miR-140-5p组、anti-miR-NC+si-circPTPRA组、anti-miR-140-5p+si-circPTPRA组。同时将未经转染的RA滑膜成纤维细胞记为NC组。

1.3.3 qRT-PCR检测circPTPRA、miR-140-5p的表达水平 研磨RA滑膜成纤维细胞与正常滑膜成纤维细胞后用Trizol试剂提供细胞总RNA,将总RNA逆转录合成cDNA,以2 μL cDNA为模板进行荧光定量PCR实验,按照试剂盒说明书操作并用2-ΔΔCt法分析circPTPRA、miR-140-5p的表达水平。

1.3.4 MTT检测细胞增殖 取各组RA滑膜成纤维细胞按照每孔5 000个细胞的密度接种于96孔板,于37 ℃培养箱内培养24 h,分别进行MTT反应并用酶标仪检测490 nm处的吸光度值。

1.3.5 Transwell实验检测细胞迁移 收集RA滑膜成纤维细胞(5×105个/毫升)加入上室中(200微升/孔),在小室加入500 μL含有20%胎牛血清的培养液,孵育24 h后取出小室,PBS洗涤后用甲醇固定20 min,结晶紫染色液染色15 min,用水冲洗后晾干,于显微镜下拍照,随机选取5个视野计数细胞数量。

1.3.6 双荧光素酶报告基因检测circPTPRA与miR-140-5p的靶向关系 构建包含miR-140-5p潜在结合序列的circPTPRA重组荧光素酶报告质粒WT-circPTPRA及包含突变结合序列的重组质粒MUT-circPTPRA,RA滑膜成纤维细胞按照每孔1×105个细胞的密度接种于12孔板,分别转染1.5 μg重组荧光素酶报告质粒与miR-140-5p mimics(100 nmol/L)或miR-NC(100 nmol/L),24 h后检测萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性,二者荧光素酶活性比值可表示circPTPRA与miR-140-5p的结合能力。

1.3.7 Western blotting检测CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达 取各组RA滑膜成纤维细胞加入100 μL蛋白裂解液(1 μL蛋白酶抑制剂与1 μL磷酸酶抑制剂)提取细胞总蛋白,BCA试剂盒检测蛋白浓度,蛋白样品煮沸后变性,按照每孔50 μg蛋白上样进行SDS-PAGE电泳反应,分离后蛋白湿转至PVDF膜,用8%脱脂牛奶室温封闭PVDF膜1.5 h,加入CyclinD1(1∶800)、MMP2(1∶800)、MMP9(1∶800)、β-actin(1∶1 000)一抗4 ℃孵育过夜,TBST洗涤后二抗(1∶2 000)孵育1 h,ECL化学发光法显示条带,用ImageJ软件分析各条带灰度值。

1.4 统计学方法 采用t检验、方差分析及q检验。

2 结果

2.1 RA滑膜成纤维细胞RA-FLSs中circPTPRA及 miR-140-5p表达情况 与Control组比较,RA-FLSs组circPTPRA的表达量升高,miR-140-5p的表达量降低(P<0.01)(见表1)。

表1 RA滑膜成纤维细胞RA-FLSs中circPTPRA及miR-140-5p表达情况

2.2 低表达circPTPRA对RA滑膜成纤维细胞RA-FLSs增殖和转移的影响 与si-NC组比较,si-circPTPRA组细胞活力降低,迁移细胞数减少,CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白水平降低(P<0.05)(见图1、表2)。

2.3 miR-140-5p对RA滑膜成纤维细胞RA-FLSs增殖和转移的影响 与miR-NC组比较,miR-140-5p组细胞活力降低,迁移细胞数减少,CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白水平降低(P<0.01)(见图2、表3)。

2.4 circPTPRA靶向miR-140-5p circPTPRA与miR-140-5p存在结合位点(见图3)。miR-140-5p过表达可明显降低野生型载体WT-circPTPRA的荧光素酶活性(P<0.01)(见表4)。circPTPRA可负向调控miR-140-5p的表达(P<0.05)(见表5)。

2.5 anti-miR-140-5p逆转si-circPTPRA对RA-FLSs增殖和转移的影响 与anti-miR-NC+si-circPTPRA组比较,anti-miR-140-5p+si-circPTPRA组细胞活力升高,迁移细胞数增多,CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白水平升高(P<0.01)(见图4、表6)。

表2 低表达circPTPRA对RA滑膜成纤维细胞RA-FLSs增殖和转移的影响

表3 miR-140-5p对RA滑膜成纤维细胞RA-FLSs增殖和转移的影响

表4 双荧光素酶活性检测

表5 qRT-PCR检测miR-140-5p的表达

3 讨论

circRNA与线性RNA不同,其不易被降解且具有组织、时序特异性,研究[8-10]发现circRNA在RA病人中表达异常,并可能作为临床诊断RA的潜在生物标志物,但circRNA在RA形成及发展过程中的作用机制尚需进一步探究。

表6 anti-miR-140-5p逆转si-circPTPRA对RA-FLSs增殖和转移的影响

circPTPRA在膀胱癌中表达下调,并可通过充当miR-636的海绵分子而上调KLF9表达进而抑制膀胱癌的发展进程[11]。有研究[12]发现circPTPRA可抑制非小细胞肺癌细胞转移。但circPTPRA在RA中的表达及其作用机制尚未可知。本研究结果显示,RA滑膜成纤维细胞中circPTPRA的表达量升高,干扰circPTPRA表达可明显降低RA滑膜成纤维细胞活力及CyclinD1蛋白水平。研究[13]表明CyclinD1与CDK4/6结合形成复合物而正向调控细胞周期,促进细胞增殖。本研究结果提示干扰circPTPRA表达可抑制RA滑膜成纤维细胞增殖。MMP2、MMP9可降解细胞外基质而促进细胞转移[14]。本研究结果显示,干扰circPTPRA表达后RA滑膜成纤维细胞迁移细胞数减少,MMP2、MMP9蛋白水平降低,提示干扰circPTPRA表达可抑制RA滑膜成纤维细胞迁移。

为进一步探究circPTPRA在RA发展过程中的作用机制,本研究证实RA滑膜成纤维细胞中circPTPRA可靶向结合miR-140-5p。miR-140-5p可促进炎症反应的发生[15]。研究[16-17]显示,miR-140-5p通过靶向FUT1抑制骨关节炎软骨细胞凋亡;miR-140-5p过表达通过下调Toll样受体4而抑制脂多糖诱导的人椎间盘炎症反应。本研究结果显示,RA滑膜成纤维细胞中miR-140-5p的表达量降低,miR-140-5p过表达可明显降低RA滑膜成纤维细胞活力及迁移能力,而抑制miR-140-5p表达可逆转干扰circPTPRA表达对RA滑膜成纤维细胞增殖及迁移的抑制作用。

综上所述,RA滑膜成纤维细胞中circPTPRA的表达量升高,而miR-140-5p的表达量降低,干扰circPTPRA表达可通过上调miR-140-5p的表达而抑制RA滑膜成纤维细胞增殖及迁移,circPTPRA可能作为RA诊断与治疗的潜在靶点。本研究不足之处在于circPTPRA是否可通过靶向调控其他miRNA表达而参与RA发生及发展过程中尚未可知。未来将进一步研究证实circPTPRA/miR-140-5p分子轴在RA发生及发展过程中的作用机制。