LINC01465 在痛风性关节炎中的表达及临床意义

肖剑伟， 蔡 旭， 黄新民， 洪易炜， 汪荣盛

（1. 深圳市福田区风湿病专科医院风湿免疫科，广东 深圳 518000；2. 上海市光华中西医结合医院风湿免疫科，上海 200052）

痛风性关节炎（gouty arthritis,GA）是一种常见的炎症性关节炎，发作时常引起患者极大的痛苦。 研究显示痛风患病率从<1%到6.8%不等，其患病率和发病率在不断上升[1-2]。GA是由于尿酸单钠晶体（monosodium urate crystal, MSU）在关节和关节周围软组织中沉积引起[3]。 MSU 诱发炎症反应，刺激局部炎症细胞分泌肿瘤坏死因子 （tumor necrosis factor，TNF）-α 和白介素（interleukin，IL）-1β 等炎症因子，进一步加重炎症[4]。 鉴于目前部分患者对药物治疗反应不佳，因而探索痛风发病的潜在机制对于其治疗具有重要意义。

长链非编码RNA（long noncoding RNA, lncRNA）为长度超过200 个核苷酸且未翻译成功能性蛋白质的RNA[5]，其主要通过在转录和转录后水平调节下游基因来实现其调控功能[6]。 多个研究动物模型研究显示，lncRNA 可通过调控炎症因子分泌等来促进或减轻GA 的发展[7-8]。另一项研究显示痛风患者的外周血单个核细胞 （peripheral blood mononuclear cell，PBMC） 中差异表达的AJ227913 可能参与痛风的发病机制。 以上研究结果表明，探索异常表达的lncRNA 可为痛风患者提供有希望的诊断和治疗靶点[9]。

本研究从基因表达综合 （Gene Expression Omnibus,GEO）数据库下载痛风相关微阵列数据集，基于机器学习的方式识别痛风患者PBMC 中的关键lncRNA， 验证关键lncRNA 表达情况及lncRNA 与炎症指标及尿酸水平的相关性， 为进一步深入了解痛风的发病机制及诊断和治疗提供新方向。

资料与方法

一、样本和差异lncRNA 获取

从GEO 数据库中以“Gout”作为关键词检索，得到数据集GSE160170（检测平台为GPL21827），共包含6 个正常样本和6 个痛风样本。 使用Perl 软件 （版本号5.36.0）对GSE160170 数据集进行基因重注释，获取mRNA 及lncRNA表达量。

二、不同机器学习获取关键基因

对得到的差异lncRNA 表达谱采用机器学习方法进一步筛选关键基因。将数据分为训练集及测试集。使用R 语言中的glmnet 包， 通过LASSO 回归对lncRNA 表达谱进行筛选。 然后使用随机森林（random forest，RF）方法，设置参数ntree=1 000，mtry=3， 取MeanDecreaseGini 排名前5 的基因作为核心基因。 将上述2 种方法计算的结果取交集得到关键基因。使用R 软件ROCR 包绘制lncRNA 的受试者操作特征曲线（receiver operating characteristic curve, ROC 曲线）用于评估lncRNA 的诊断能力。

三、与lncRNA 共表达编码蛋白基因获取

将得到的lncRNA 通过R 软件limma 包，分析其共表达的蛋白编码基因，将共表达基因通过String 网站（https://stringdb.org）进行蛋白质互作网络分析，导入Cytoscape 软件（版本号3.8.2），通过cytoHubba 插件筛选HUB 基因。

四、基因本体论（Gene Ontology，GO）富集分析及京都基因与基因组百科全书 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）信号通路分析

将得到的共表达蛋白编码基因，使用R 软件“clusterProfiler”包及“org.Hs.eg.db”进行GO 富集分析及KEGG 信号通路分析。 以P<0.05 为差异具有统计学意义。

五、实验验证

1. 临床样本资料： 选取深圳市福田区风湿病专科医院风湿免疫科符合2012 美国风湿病协会制定的痛风诊断标准，排除合并有恶性肿瘤、发病前3 d 服用过非甾类药物或激素类药物以及严重肝功能、肾功能障碍的患者。纳入2021年4—10月确诊的急性GA 发作患者共10 例， 其中男性9例，女性1 例，年龄33～57 岁，平均（40.9±9.2）岁。 收集患者红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、C 反应蛋白（C reactive protein，CRP）、IL-6 及血尿酸等临床资料。按照痛风患者性别、年龄比例选择10 名我院健康体检者作为对照组，其中男性8 名，女性2 名，年龄40～56 岁，平均（46.2±5.7） 岁。 2 组之间年龄差异无统计学意义 （t=-1.554，P=0.196）。 本研究通过医院伦理委员会审查 （伦理审查编号：FS202110002），研究对象均自愿参与，签署知情同意书。

2. 试剂：淋巴细胞Ficoll-Hypaque 分离液购自上海善然生物科技公司，TRIzol 试剂购自美国赛默飞世尔科技公司，PrimeScript RT 逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ荧光定量试剂盒购自日本TaKaRa 公司。

3. RNA 提取及实时荧光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）： 使用含有乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA）的采血管收集对照组及痛风组患者的外周血3 mL，通过Ficoll-Hypaque 密度梯度离心法分离和纯化PBMC， 磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution, PBS）冲洗3 次，置于-80 ℃保存。 各研究对象取PBMC 约3×106个， 使用TRIzol 试剂从PBMC 中提取总RNA， 并使用NanoDrop One 超微量紫外分光光度计检测RNA 吸光度（A），取A260nm/A280nm值为1.8～2.0 的样本用于后续实验。 RNA 样本置于-80 ℃保存。

按照PrimeScript RT 逆转录试剂盒说明书操作。 将2 μL RNA 样本逆转录为互补DNA （complementary DNA，cDNA），随后按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ说明书在Applied Biosystems 7500 实时PCR 系统上进行qRT-PCR。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）为内参，其中LINC01465 引物序列（5’- 3’）上游为AAGCAAGCCTGGGCAATG，下游为TAACAAATCACCCTGAAAC；GAPDH引物序列（5’- 3’）上游为GCCCAATACGACCAAATCC，下游为AGCCACATCGCTCAG ACAC。LINC01465 的qRT-PCR 反应系统包含2 μL cDNA、正向和反向引物各0.8 μL、10×ROX reference dye Ⅱ0.4 μL、2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ10 μL、RNase Free ddH2O 6 μL， 总体积为20 μL。 循环参数：97 ℃10 min；95 ℃15 s，62 ℃60 s，共40 个循环。 LINC01465 于62 ℃时使用High Resolution Melting Software v3.0.1 软件采集荧光信号，并分析熔解曲线。采用2-△△Ct法以GAPDH 为内参计算LINC01465 的表达水平，并计算LINC01465 与ESR、CRP、IL-6 及尿酸水平的相关性。

六、统计学方法

结果

一、差异分析结果

与健康体检者对比，GA 患者共有37 个lncRNA 差异表达（见图1）。

图1 健康体检者与GA 患者差异表达lncRNA

二、机器学习结果

Lasso 回归筛选得到3 个关键基因（LINC01465、LINC01355、LINC02100），RF 算 法 筛 选 得 到5 个 关 键 基 因（FARP1.AS1、LINC01465、FAM242C、IFNG.AS1、PACERR），2 个结果取交集，得到潜在生物标志物LINC01465（见图2）。ROC 诊断曲线下面积 （area under the curve， AUC）=0.889，P=0.001（见图3）。

图2 Lasso 回归与RF 算法筛选关键基因

图3 ROC 诊断曲线

三、LINC01465 共表达基因分析结果

共表达结果显示， 共有1 516 个蛋白编码基因余LINC01465 共表达。 HUB 基因筛选结果显示， 在整个网络中，缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF1α）、磷脂酰肌醇-3 激酶催化亚基α （phosphoinositide-3 kinase catalytic alpha polypeptide，PIK3CA）、IL-6、 哈维大鼠肉瘤病毒肿瘤基因同源物 （Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog, HRAS）、β-连环素1（β-catenin 1, CTNNB1）处于网络核心，其表达与LINC01465 表达均呈正相关（见图4）。

图4 LINC01465 共表达分析及HUB 基因

四、GO 富集分析及KEGG 信号通路分析

GO 富集分析结果显示，其生物过程（biological process,BP）包括RNA 剪接、氧化磷酸化等，分子功能主要包括抗氧化活性、 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 （reduced nicotinamide adenine dinucleotide，NADH） 脱氢酶活性等功能，细胞成分显示主要定位于线粒体内膜、呼吸链复合体等（见图5A）。 KEGG 信号通路分析显示主要富集于烟酸和烟酰胺代谢、TNF 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、 趋化因子信号通路等代谢及炎症通路（见图5B）。

图5 GO 富集分析及KEGG 信号通路分析结果

五、实验结果

qRT-PCR 结果显示， 在痛风患者中LINC01465 表达明显升高（P=0.030）（见图6）。 相关性分析显示，LINC01465 表达与ESR （r=0.658，P=0.030）、CRP （r=0.660，P=0.040）、IL-6（r=0.794，P=0.008） 表达呈正相关， 与尿酸无相关性 （r=0.450，P=0.190）（见图7）。 ROC 诊断曲线显示AUC=0.860，P=0.001（见图8）。

图6 LINC01465 在对照组及GA 组中qRT-PCR 结果

图8 ROC 诊断曲线

讨论

机器学习在风湿免疫疾病风险因素预测、治疗愈后效果预测等方面得到广泛应用。 笔者通过使用机器学习鉴定类风湿关节炎的潜在关键基因[10]。另一项研究通过多种机器学习方法，构建了系统性红斑狼疮风险概率指数，用于狼疮患者的早期诊断和治疗[11]。与传统通过不同分组寻找差异表达的方法相比，机器学习的方法能够更加准确地识别出GA 诊断及治疗潜在相关的lncRNA。

目前，GA 的诊断主要依赖于血清尿酸水平的升高。 但研究表明，GA 与高尿酸血症的相关性尚不明确。 高尿酸血症使患者容易出现痛风急性发作， 但也有很多高尿酸血症患者无明显症状，部分GA 患者尿酸亦无明显升高[12]。 血液尿酸水平不能预测GA 的发作， 也并非GA 诊断的标志物。寻找有效的生物标志物，对GA 进行早期诊断及治疗对于预防关节畸形及提高患者的生活质量有重要意义，阐明GA 的发病机制对于疾病的早期诊断和治疗至关重要。

大量研究表明，lncRNA 调控在各种风湿性疾病的发生和发展中发挥重要作用[13]。 目前关于lncRNA 在GA 患者中的研究仍较少。本研究中GA 急性发作患者LINC01465 表达明显上调。 芯片数据及实验验证均显示其具有良好的分类诊断功能，AUC 均大于0.8， 提示LINC01465 能作为GA 患者的诊断标志物之一。 同时，LINC01465 与ESR、CRP、IL-6等炎症因子表达呈正相关，而与血清尿酸水平无明显相关，提示LINC01465 与痛风急性发作有关， 也可能是急性期发作的生物标志物。

本研究通过与LINC01465 共表达的蛋白来推测其潜在功能。 HUB 基因筛选得到5 个关键基因， 分别是HIF1α、PIK3CA、IL-6、HRAS、CTNNB1。其中，PIK3CA 由1 个85 kDa的调节亚基和1 个110 kDa 的催化亚基组成， 是PI3K 通路的组成部分[14]。 研究显示，尿酸结晶会触发脾酪酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）激活PI3K 信号通路诱导细胞因子的产生导致炎症[15]。HRAS 是肾素-血管紧张素系统（reninangiotensin system, RAS）基因产生4 种主要的蛋白质产物之一， 另外3 个为Kirsten 大鼠肉瘤病毒肿瘤基因同源物（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS4） 的2 个异构体KRAS4A 和KRAS4 以及神经母细胞瘤RAS 病毒肿瘤基因同源物 （neuroblastoma RAS viral oncogene homolog,NRAS）。 这4 个蛋白具有高度同源性的序列和结构，且都具有保守的G 结构域和C 端高突变区。RAS 属于鸟苷三磷酸（guanosine triphosphate，GTP）酶家族，是细胞增殖、迁移、凋亡和存活的调节剂[16]。 RAS 蛋白与鸟苷二磷酸（guanosine diphosphate，GDP）结合时处于非活性状态（RASGDP），与GTP 结合处于活性状态（RAS-GTP）。 RAS-GTP 与下游效应器[包括Raf、PI3K、Ral 鸟嘌呤核苷酸交换因子（Ral guanine nucleotide exchange factors，RalGEF）]结合，转导信号以调节生物行为[17-19]。 前2 个相应的通路RAS-Raf-丝裂原活化的细胞外信号调节激酶（mitogen extracellular signal regulated kinase, MEK）-细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinase, ERK）和RAS-PI3K-Akt-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物 （mammalian target of rapamycin complex,mTORC），是RAS 蛋白的基本信号通路[18]。 由此可见，PIK3CA蛋白与HRAS 之间相互联系，HRAS 可能通过激活PIK3CA进而激活PI3K-Akt 信号通路。 Cavalcanti 等[20]观察到痛风患者血清中IL-6 水平与痛风石（P=0.005）和关节畸形（P=0.000 8）相关。动物实验发现，尿酸结晶可刺激M1 巨噬细胞产生IL-6，介导中性粒细胞浸润，进而产生炎症级联反应，加重炎症反应，形成恶性循环[21]。 提示IL-6 在GA 中发挥重要作用。HIF 由HIF1α 和HIF1β 2 个亚基组成。当局部炎症发生时，血流速度减慢，炎症细胞耗氧量增加导致局部环境缺氧，HIF 活化，参与NF-κB 活化和糖酵解[22]。 糖酵解可诱发炎症反应， 还可促进NLRP3 炎性小体的活化以及IL-6 和IL-1β 等炎性细胞因子的分泌[23]。有研究表明，几丁质可通过抑制巨噬细胞中HIF1α 和NLRP3 的表达来减少IL-1β 的分泌，从而治疗GA[24]，表明HIF1α 可能通过调节NLRP3 通路对GA 产生影响。 CTNNB1 蛋白又名为β-连环素， 是经典Wnt 信号通路的关键下游组分。 研究发现，尿酸能够显著促进小鼠巨噬细胞中β-连环素的表达， 促进巨噬细胞M1 极化和迁移，从而促进炎症[25]。

5个关键基因涉及PI3K/Akt、NF-κB及Wnt 信号通路，功能涉及到炎症反应、 糖酵解等， 这与GO 富集分析及KEGG 信号通路分析一致。 而3 个通路之间存在交互作用，其中PI3K-Akt 处于几个通路的核心地位。 研究显示，PI3KAkt 通路通过激活NF-κB 在炎症反应中发挥重要作用，而NF-κB 也是激活NLRP3 炎性体的上游信号之一[26]。 PI3K 抑制剂可减少骨关节炎大鼠的中性粒细胞凋亡和软骨细胞炎症[27]。 β-连环素与NF-κB 形成复合物，负调节NF-κB 活性，导致NF-κB 靶基因表达降低[28]。在树突细胞中，敲低β-连环素增强了脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的NF-κB 活化和促炎细胞因子的产生[29]。 这些研究揭示了β-连环素的抗炎作用， 并且β-连环素信号传导使树突细胞进入耐受状态， 从而限制炎症反应。 多项研究显示HIF1α 受PI3K/Akt/mTOR 信 号 通 路 的 调 节[30-31]。 PI3K 抑 制 剂LY294002[32]和PI3K/mTOR 双重抑制剂NVP-BEZ235[33]可抑制由缺氧引起的Akt 活化和HIF1α 的表达。 HIF1α 激活可上调己糖激酶的表达水平[34]，己糖激酶是一种限速酶，能够促进细胞内葡萄糖不可逆磷酸化为6-磷酸葡萄糖， 使葡萄糖分子进入糖酵解循环，从而增强糖酵解。 这种多个通路之间的相互作用高度提示5 个关键基因通过复杂的调控在GA 的发病中发挥重要作用， 而LINC01465 可能影响1 个或多个关键基因的转录或翻译来达到调控的目的。

综上，本研究确定了LINC01465 为GA 潜在的诊断和治疗靶点，并在患者中对其表达进行了验证。 然而，对于其具体的作用机制及生物学功能仍需进一步研究来验证。