子宫内膜癌患者血清和癌组织中LncRNA CRNDE、miR-153-5p表达及临床诊断价值

王丽娟 吴文 林秀芬

子宫内膜癌(endometrial carcinoma,EC)是主要的妇科恶性肿瘤,在全球女性恶性肿瘤中排名第四位,仅次于乳腺癌、肺癌和结直肠癌。EC主要影响更年期女性并引起系列症状,包括盆腔疼痛、排尿疼痛和阴道出血[1,2]。目前EC的治疗主要以化疗、免疫治疗和内分泌治疗方式为主,但EC患者的总体生存率依然很低[3,4]。据报道,循环miRNA对EC患者具有诊断意义[5]。研究表明miR-153-5p是一种抑癌因子,与肿瘤的生长、浸润以及转移等发展密切相关[6]。长链非编码RNA(LncRNA)不参与蛋白质合成,但可以在多个水平上调节基因表达以参与包括癌症在内的多种人类疾病,其中LncRNA CRNDE是一种新型的基因,在多种肿瘤疾病中过表达,参与肿瘤的发生和发展[7]。因此,本研究通过检测EC患者癌组织和血清中miR-153-5p和LncRNA CRNDE的表达情况,探讨二者与患者临床病理参数的关系以及对EC患者的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年12月至2021年12月海南医学院第二附属医院进行手术治疗的115例EC患者作为观察组,收集术中患者的EC组织(n=115)和癌旁组织(n=115),115例EC组织均经病理学证实。术后,将所收集样本立即置于液氮中冷冻,然后转移并储存在-80°C中直至进一步使用。EC患者年龄38～76岁,平均年龄(57.61±10.24)岁;组织病理类型:腺癌90例,透明细胞癌7例,鳞癌7例,混合性癌8例,浆液性癌3例;国际妇产科联盟(FIGO)分期:Ⅰ期+Ⅱ期52例,Ⅲ期+Ⅳ期63例;肌层浸润程度:≥1/2肌层78例,<1/2肌层37例;分化程度:中+低分化74例,高分化41例;淋巴结转移68例,无淋巴结转移47例;肿瘤直径≥5 cm 69例,<5 cm 46例。同期选取100例体检健康者为对照组,2组一般资料具有均衡性。本研究经医院道德伦理委员会批准通过,样品采集均取得受试者知情同意,符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准:①经手术病理确诊为EC;②患者均未进行过放疗或化疗;③无自身免疫疾病。

1.2.2 排除标准:①合并其他恶性肿瘤、或重大疾病患者;②精神无法自控或异常者;③临床资料不完整者。

1.3 方法

1.3.1 血清标本采集:对照组于体检当天、观察组于术前均采集空腹静脉血5 ml,采用10 000 r/min低温离心处理15 min后,取血清置于-80℃保存备用。

1.3.2 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测血清和癌组织中LncRNA CRNDE、miR-153-5p表达水平:使用TRIzol®试剂从EC组织、癌旁组织及2组血清中提取总RNA。NanoDrop 2000(Thermo Scientific)用于测量RNA浓度。然后,根据说明,应用M-MLV Reverse Transcriptase Kit进行RNA逆转录得到cDNA。BlazeTaqTMOne-Step SYBR Green RT-qPCR Kit (Genecopoeia)用于检测LncRNA CRNDE表达水平。All-in-One miRNA qRT-PCR RECgent Kit (Genecopoeia)用于检测miR-153-5p表达水平。GAPDH用作LncRNA CRNDE的内参对照。U6用作miR-153-5p的内参对照。使用2-ΔΔCt计算方法对LncRNA CRNDE、miR-153-5p表达水平进行定量分析。见表1。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

2 结果

2.1 2组血清中LncRNA CRNDE、miR-153-5p的表达水平 EC患者血清中miR-153-5p表达水平低于对照组,LncRNA CRNDE表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2组血清中LncRNA CRNDE、miR-153-5p表达水平比较

2.2 EC患者癌组织中LncRNA CRNDE、miR-153-5p的表达水平 EC患者癌组织中miR-153-5p表达水平低于癌旁组织,LncRNA CRNDE表达水平高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 癌组织及癌旁组织中LncRNA CRNDE、miR-153-5p表达水平比较 n=115,

2.3 miR-153-5p、LncRNA CRNDE表达的相关性 EC患者血清中miR-153-5p、LncRNA CRNDE表达呈明显负相关(r=-0.315,P<0.05)。EC患者癌组织中miR-153-5p、LncRNA CRNDE表达呈明显负相关,(r=-0.268,P<0.05)。见图1、2。

图1 EC患者血清中miR-153-5p、LncRNA CRNDE表达相关性分析

图2 EC患者癌组织中miR-153-5p、LncRNA CRNDE表达相关性分析

2.4 血清miR-153-5p、LncRNA CRNDE表达水平与EC患者临床病理参数的关系 EC患者血清中LncRNA CRNDE、miR-153-5p表达水平均与患者年龄、肿瘤直径、组织类型无关(P>0.05);均与肌层浸润深度、分化程度、淋巴结转移、FIGO分期有关,差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 患者血清中miR-153-5p、LncRNA CRNDE表达水平与临床病理参数的关系

2.5 血清中LncRNA CRNDE、miR-153-5p表达水平对EC的诊断价值 ROC曲线结果显示,血清miR-153-5p、LncRNA CRNDE表达水平诊断EC发生的曲线下面积分别为0.901(95%CI:0.855～0.936)、0.944(95%CI:0.906～0.970),二者单独应用时对应的敏感度分别为90.43%、87.83%,特异度分别为76.52%、92.17%;血清LncRNA CRNDE、miR-153-5p水平联合诊断的曲线下面积为0.971(95%CI:0.940～0.988),敏感度为89.57%,特异度为98.26%。见表5,图3。

表5 血清LncRNA CRNDE、miR-153-5p表达水平对EC的诊断价值

图3 血清LncRNA CRNDE、miR-153-5p表达水平诊断EC发生的ROC曲线

3 讨论

EC是一种起源于子宫内膜上皮的恶性肿瘤,威胁着女性的健康。尽管统计数据不完整,但2020年全球约新增病例65 620例,死亡12 590例。在发达国家,子宫内膜癌的发病率为5.9%,高于发展中国家(4.0%),并继续呈上升趋势[8]。EC的病因明确,研究显示可能与不孕不育、肥胖、糖尿病等相关[9]。目前缺乏对EC的早期诊断方法以及诊断标志物,因此探究新的诊断标志物,对于帮助疾病的早期治疗和改善患者预后具有重要意义。

miRNAs是一类小的非编码RNA分子,它们通过结合其靶mRNA的3’-非翻译区(3’-UTR)来调控基因表达。几十年来,miRNA已被广泛研究,并已被提议作为癌症治疗的潜在分子靶标[10]。miR-153-5p被报道在癌症的转移、复发和发展中发挥重要作用[11]。孙云菊等[12]研究表明miR-153-5p在乳腺癌组织中表达水平降低,与疾病发展密切相关。Liu等[13]研究表明miR-153在宫颈癌组织中表达降低,且与肿瘤的大小、淋巴结转移等病理特征有关。本研究中,EC患者癌组织及血清中miR-153-5p表达水平均降低,提示miR-153-5p可能通过发挥抑癌基因的作用,参与调控EC的发生、发展过程;本研究进一步发现,患者血清中miR-153-5p表达水平与患者年龄、肿瘤直径、组织类型无关,但与肌层浸润深度、分化程度、淋巴结转移、FIGO分期有关,提示miR-153-5p与EC的发生及其临床病理特征存在密切关系。ROC曲线结果显示,血清中miR-153-5p表达水平诊断EC发生的曲线下面积为0.901(95%CI:0.855～0.936),对应的敏感度为90.43%,特异度为76.52%,提示血清miR-153-5p水平可在一定程度作为诊断EC发生的标志物。

LncRNA是一组长度>200个核苷酸的非编码RNA,已成为细胞周期、增殖、分化、凋亡、侵袭和迁移等多种细胞过程中必不可少的调节因子。LncRNAs的失调已在大量人类癌症中得到报道[14]。此外,一些LncRNA参与EC发生发展的进程也已得到证实[15]。LncRNA CRNDE位于人类第16号染色体中,在细胞发育和分化中发挥重要作用。多项研究表明,在包括肝癌和结直肠癌在内的许多实体瘤中,LncRNA CRNDE水平上调[16]。杨向绸等[17]研究表明LncRNA CRNDE在弥漫性大B细胞淋巴瘤中呈高表达,与疾病的发生有关。Yang等[18]研究发现LncRNA CRNDE在宫颈癌患者组织中呈高表达,且与疾病分期、淋巴结转移等存在一定关系。

在本研究中,患者癌组织中LncRNA CRNDE表达水平与癌旁组织相比明显升高,且患者血清中LncRNA CRNDE表达水平高于健康体检者,提示LncRNA CRNDE可能在疾病中发挥促癌基因的作用,参与了EC的发生发展。本研究进一步发现血清LncRNA CRNDE表达水平与患者年龄、肿瘤直径、组织类型无关,但与肌层浸润深度、分化程度、淋巴结转移、FIGO分期有关,提示LncRNA CRNDE参与了EC的发生发展,且与疾病临床病理特征密切相关;进一步研究发现EC患者血清中miR-153-5p和LncRNA CRNDE的表达水平呈负相关(r=-0.315,P<0.05),且EC患者癌组织中miR-153-5p和LncRNA CRNDE的表达水平也呈负相关(r=-0.268,P<0.05)提示二者之间可能存在某种负反馈机制,共同作用于EC的发生发展过程;ROC曲线结果显示,血清中LncRNA CRNDE表达水平诊断EC发生的曲线下面积为0.944(95%CI:0.906～0.970),敏感度为87.83%,特异度为92.17%,LncRNA CRNDE与miR-153-5p二者联合诊断的曲线下面积为0.971(95%CI:0.940～0.988),敏感度为89.57%,特异度为98.26%,提示LncRNA CRNDE、miR-153-5p二者联合应用于诊断EC发生的临床价值优于单一指标。

综上所述,miR-153-5p在EC患者癌组织及血清中均表达降低,LncRNA CRNDE表达水平均升高,二者可能通过某种负反馈调节机制共同参与EC的发生发展,且联合检测二者表达水平对EC具有较高的临床诊断价值。对临床EC患者的早期诊断和治疗提供重要参考价值。