细胞程序性死亡配体1表位肽疫苗的设计及抗肿瘤活性

邵世帅，段树康，田 浤，姚文兵，高向东

（中国药科大学生命科学与技术学院 江苏省生物药物成药性研究重点实验室，南京 211198）

免疫检查点阻断（ICB）疗法在癌症治疗方面取得了前所未有的进展，极大地改变了肿瘤治疗策略［1-2］。以PD-1/PD-L1 为靶点的单克隆抗体被证明在晚期黑色素瘤、非小细胞肺癌、胃癌等多种恶性肿瘤中表现出较为显著的临床疗效和抗肿瘤活性［3-6］，但免疫检查点阻断疗法仅对部分患者产生持久反应，对大多数癌症患者仍然无效［7-8］。

ICB 介导的抗肿瘤反应依赖于能够识别并杀伤肿瘤细胞的T 细胞的浸润情况［9］，免疫细胞如CD8+T 细胞影响着免疫治疗的疗效与癌症患者的生存期［10］。肿瘤疫苗可诱导CD8+T 细胞的增殖，在某些情况下，这些T 细胞可被招募至肿瘤组织中［11］。因此，将ICB与肿瘤疫苗联用是提高临床疗效较为合理的方案。肿瘤新生抗原疫苗是治疗性肿瘤疫苗的最新进展［12］，已有多项新生抗原疫苗与ICB 联合应用的临床研究正在进行中［13］。然而并非每一种突变都能产生新生抗原。据报道，自发发生的新生表位特异性T 细胞只反映个体肿瘤突变的1% ～ 2%［14］。因此选择可在多种肿瘤类型中高表达的肿瘤相关抗原，设计出惠及更多肿瘤患者的肿瘤疫苗仍是更为现实有效的疫苗策略。

免疫检查点PD-L1 是一种在正常组织中低表达，可在肿瘤部位诱导高表达的“适应性”的肿瘤相关抗原［15-16］。在癌症的发展过程中，肿瘤通过高表达PD-L1 与其受体PD-1 相互作用抑制T 细胞反应，逃避肿瘤免疫监视，从而抑制抗肿瘤免疫反应［17］。有研究发现PD-L1 几乎可以在所有的小鼠肿瘤细胞系上诱导表达［18］。因此，PD-L1被认为是肿瘤免疫治疗的理想靶点。此外，细胞毒性T细胞（CTL）释放的IFN-γ是反应性PD-L1表达的最强刺激物［19］，因此将PD-L1 作为肿瘤疫苗的靶点，靶向PD-L1 的CTL 理论上可以在肿瘤部位通过正反馈调节不断地发起对PD-L1阳性肿瘤细胞的杀伤。

本研究以免疫检查点PD-L1为肿瘤疫苗靶点，预测PD-L1的CTL 表位肽和线性B 表位肽，并与硝基化辅助T 细胞表位连接，设计靶向PD-L1 的表位肽疫苗。硝基化辅助T 细胞表位是本课题组前期设计的能够打破自体蛋白免疫耐受的CD4+T 表位，研究表明CD4+T 细胞对于诱导强大的CTL 反应和CD8+记忆性T 细胞是十分必要的［20］。因此，本研究筛选并验证了PD-L1表位肽的免疫原性，并在小鼠肿瘤模型中研究了PD-L1-B1表位肽疫苗的抗肿瘤活性，同时初步探究了PD-L1-B1 表位肽疫苗对肿瘤微环境的影响。

1 材 料

1.1 试 剂

IFN-γ EliSpot 检测试剂盒（德国AID 公司）；CpG 1018（北京擎科生物科技有限公司）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗小鼠IgG 抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）；AF488标记的羊驼抗人IgG抗体（美国杰克逊公司）；RPMI 1640培养基、DMEM高糖培养基、EasyPure RNA Kit 试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）；胎牛血清（FBS，美国Gibco公司）；红细胞裂解液、FITC 标记的抗小鼠CD45抗体、BB700 标记的抗小鼠CD3 抗体、PE 标记的抗小鼠CD4 抗体、APC 标记的抗小鼠CD8 抗体（美国BD 公司）；7AAD 活性染色溶液、CFSE 细胞增殖试剂盒（美国赛默飞公司）；HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京诺唯赞生物科技公司）；mPDL1 蛋白、hPDL1蛋白（课题组设计并合成纯化，纯度大于80%）。

1.2 动物和细胞株

重度免疫缺陷（NPI）雌性小鼠，6 ～ 8周龄，SPF级，购自北京艾德摩生物技术有限公司，合格证号：SCXK（京）2022-0001；BALB/c 雌性小鼠（6 ～ 8周龄），SPF级，购自杭州子源实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK（浙）2019-0004。所有动物实验均符合中国药科大学动物伦理委员会标准。

小鼠肝癌细胞株H22、小鼠结肠癌细胞株CT26、人黑色素瘤细胞株A375、小鼠黑色素瘤细胞株B16F10（中国药科大学江苏省生物药物成药性研究重点实验室保存）。

1.3 仪 器

Nanodrop 2000分光光度计、QuantStudio 3 PCR仪、高速冷冻离心机（美国赛默飞公司）；Countstar细胞计数仪（上海泽权仪器设备有限公司）；BD Accuri C6 Plus流式细胞仪（美国BD公司）。

2 方 法

2.1 免疫检查点PD-L1表位预测与肽疫苗设计

免疫检查点PD-L1 分子胞外区和跨膜区蛋白序列由Uniprot 数据库（http：//www. uniprot. org）查询得到。随后，通过免疫表位在线预测数据库IEDB（http：//www. iedb. org）对PD-L1 胞外和跨膜序列进行CTL 表位和线性B 表位预测。综合分析所有预测结果，选择预测排名好、亲和力高、半衰期长的表位进行合并设计，使所设计的CTL 表位肽可至少针对两个不同的主要组织相容性复合体MHC Ⅰ类分子。最后通过柔性肽将PD-L1表位肽与硝基化辅助T 细胞表位连接，设计成PD-L1表位肽疫苗。所有的表位肽由合肥合生生物工程有限公司进行合成，合成肽的纯度大于95 %。

2.2 免疫原性验证实验

2.2.1 人外周血单个核细胞（hPBMC）的分离与孵育 吸取无菌PBS 将滤器中残留血液冲出稀释，离心管中加入人淋巴细胞分离液15 mL，然后缓慢加入血液25 mL。采用密度梯度离心，1 850 r/min离心25 min。用一次性吸管吸取PBMC 细胞层（乳白色）到离心管中，补加PBS 至40 mL，1 420 r/min离心10 min。加入红细胞裂解液3 mL 重悬，裂解10 min。加入PBS至30 mL，1 600 r/min离心3 min，室温洗涤两次。用RPMI 1640完全培养基重悬，稀释，计算细胞数量以及存活率。将人白细胞抗原（HLA）分型匹配的PBMC 铺板，每个培养皿2 × 107个细胞。每个肽孵育50 μg，37 ℃、5% CO2过夜培养。

2.2.2 NPI 小鼠人源免疫系统重建和免疫方案将NPI小鼠按照体重随机分成3组，每组4只，分别为溶剂对照组、PD-L1-B1 组、PD-L1-B2 组，确保分组后组间小鼠体重没有显著性差异。尾静脉移植约1 × 107个PBMC，重建人免疫系统。第2 天皮下免疫表位肽疫苗，此后每周免疫1 次，共3 次。每只小鼠接种PD-L1-B 表位肽50 μg 和佐剂CpG 1018 20 μg 的混合溶液，每3 天记录一次小鼠的体重和移植物抗宿主病（GVHD）情况。

2.2.3 PD-L1 蛋白的构建和纯化 将小鼠PD-L1蛋白胞外区（19-239）与硝基化辅助T 细胞表位融合构建mPD-L1 蛋白，将人PD-L1 蛋白胞外区（19-238）与硝基化辅助T 细胞表位融合构建hPDL1 蛋白。mPD-L1 和hPD-L1 蛋白的表达和纯化同文献［21］所述。随后，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、Western blot 对纯化的PD-L1疫苗进行分析验证，蛋白纯度大于80%。

2.2.4 ELISA 评价PD-L1-B 表位肽的免疫原性分别于免疫后第7、14、21、24天对小鼠进行眼底静脉丛取血，6 000 r/min 离心30 min，取上清液即为所需抗血清，选择免疫系统重建成功的HIS 小鼠，取抗血清以1∶100 比例进行稀释后检测PD-L1 特异性抗体滴度。hPD-L1蛋白作为抗原包被于酶标条中，37 ℃孵育2 h。PBST 洗涤5 次，然后用5%BSA 封闭过夜。PBST 洗涤5 次，加入稀释的小鼠抗血清，37 ℃孵育2 h。PBST 洗涤6 次，接着用HRP 标记的山羊抗人二抗37 ℃孵育45 min。PBST 洗涤7 次。加入显色剂显色，37 ℃避光孵育15 min。用1 mol/L H2SO4终止反应，使用酶标仪在450 nm、630 nm处读取吸收度。

2.2.5 流式检测抗血清中PD-L1-B1 抗体与天然PD-L1受体的结合 以高表达PD-L1的肿瘤细胞为靶细胞（如A375、B16F10）。收集靶细胞并计数，使每个样本细胞数量为2 × 105个。加入含1% FBS 的PBS 1 mL 洗涤细胞，1 769 r/min 离心5 min，弃上清。加入按1∶100稀释的小鼠抗血清100 μL，室温孵育30 min。1 769 r/min 离心5 min，弃上清液。PBS洗涤3次，将细胞重悬于PBS 0.1 mL中。加入AF488 标记的羊驼抗人IgG 二抗，室温孵育1 h。PBS洗涤2次，最后重悬细胞于PBS 0.2 mL中。在流式细胞仪上分析抗体结合的细胞荧光强度。

2.2.6 IFN-γ EliSpot 评价PD-L1-T 表位肽的免疫原性 准备IFN-γ EliSpot试剂板，加入灭菌PBS清洗4 次。然后加入RPMI 1640 完全培养基，室温静置孵育30 min。倒弃培养基，随后在各孔中加入对应的刺激物，其中刺激用肽每孔10 μg，阳性刺激物每孔0.3 μL。接着加入小鼠脾脏淋巴细胞悬液，每孔5 × 105个细胞，设置阳性对照和阴性对照。37 ℃、5% CO2条件下培养24 h。PBS洗涤5次。加入稀释的IFN-γ 抗体，室温孵育2 h。PBS 洗涤5 次，加入过滤后的显色液，避光显色20 min。用去离子水洗涤正反面及底座3 ～ 5 遍，终止显色。将板条避光密封保存，酶联免疫斑点分析仪读取数据。

2.3 PD-L1-B1表位肽的抗肿瘤活性评价

2.3.1 H22 肝癌肿瘤模型构建及动物分组BALB/c 小鼠腹腔移植2 × 106个H22 细胞，腹腔培养10 d后，抽取腹水，分离H22细胞，37 ℃、5% CO2过夜培养。第2 天，每只BALB/c 小鼠于右后肢靠背部位皮下注射5 × 105个H22 细胞。当肿瘤直径达到3 ～ 5 mm 时，选择造模成功且肿瘤形态规则的小鼠，以肿瘤体积大小为标准进行随机区间分组，确保组间小鼠肿瘤体积和体重大小没有显著性差异。将小鼠分为3 组，分别为溶剂对照组、PD-L1 组、PD-L1-B1 组，每组8 ～ 10 只。其中PDL1 组免疫的是实验室前期验证有抗肿瘤活性的mPD-L1 蛋白，用于比较PD-L1-B1 表位肽疫苗与PD-L1蛋白疫苗的抑瘤效果。

2.3.2 免疫方案 分组当天（第0天）进行皮下免疫，溶剂对照组注射生理盐水，PD-L1 组和PD-L1-B1 组免疫用的蛋白和表位肽（50 μg）与佐剂CpG 1018（20 μg）混合后接种。随后在第7、14 天进行两次免疫，共免疫3次。从第0天开始，每3天进行一次体质量和肿瘤测量。

2.4 CTL效应检测

将200 μL，5 × 104个靶细胞提前铺于48孔板。37 ℃、5% CO2培养4 h。收集过夜刺激孵育的脾脏淋巴细胞到离心管中，1 200 r/min离心5 min。加入PBS 10 mL，1 200 r/min 离心5 min。加入适量的PBS重悬细胞，添加CFSE，使其终浓度为2 μmol/L，立即混合并在室温下避光孵育7 min。通过添加4倍体积的预冷的完全培养基（含≥10 %血清）停止标记，并在冰上孵育10 min，1 200 r/min离心5 min。用预冷的完全培养基洗涤细胞2 次，1 200 r/min 离心5 min。加入完全培养基重悬计数，按照50∶1 效靶比进行铺板，每孔200 μL，2.5 × 106个细胞。摇匀，孵育24 h。收集培养基，再加入PBS洗涤，收集上清液。向孔中加入胰酶200 μL消化，加入完全培养基200 μL 终止消化，吹打收集细胞，1 769 r/min离心5 min。加入PBS 1 mL 重悬，1 769 r/min 离心5 min。用70 μm 滤膜过滤，每孔在上样前5 min 加入7AAD（靶细胞单染加7AAD 0.5 μL）5 μL，混悬。流式细胞仪检测细胞杀伤活性。

2.5 小鼠肝癌肿瘤浸润淋巴细胞检测

取实体肿瘤组织新鲜标本，用手术剪去除坏死及脂肪组织，选取癌细胞集中和细胞活力较好的部位。将组织切成直径1 ～ 2 mm 的碎块，随后将肿瘤组织转移至装有消化酶的离心管中。37 ℃水浴消化40 min，每隔2 ～ 3 min 颠倒混匀。将细胞悬液经70 μm 滤网过滤，PBS 冲洗，收集滤液，1 769 r/min 离心7 min。加入PBS 重悬细胞。设置实验组、单染组和空染组，每个样本取2 × 106个细胞，加入PBS 重悬细胞1 mL，1 769 r/min 离心5 min。加入含1% BSA 的PBS 1 mL 重悬细胞，1 769 r/min 离心5 min。加入FITC 标记的抗小鼠CD45 抗体、BB700 标记的抗小鼠CD3 抗体、PE 标记的抗小鼠CD4 抗体、APC 标记的抗小鼠CD8 抗体，CD45、CD3、CD4、CD8 单染管加入对应的流式抗体，4 ℃避光孵育30 min。每管加入PBS 1 mL 洗涤，1 769 r/min离心5 min。加入PBS 600 μL重悬细胞，过滤后，流式细胞仪检测肿瘤浸润淋巴细胞。

2.6 肿瘤组织RNA分离提取和qRT-PCR

每个小鼠肿瘤样本称取20 mg，放入液氮预冷的研钵中研磨成粉，随后使用EasyPure RNA Kit 试剂盒提取肿瘤组织RNA。使用Nanodrop 2000 检测RNA 的浓度和纯度。使用HiScript Ⅲ RT Super-Mix for qPCR 试剂将每个样本的1 μg 总RNA 反转录为cDNA，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 试剂盒通过qRT-PCR 检测基因表达差异。实验步骤按照试剂盒操作说明书进行。

2.7 统计学分析

使用GraphPad Prism 8.0 软件进行数据统计学分析，各项结果以±s表示。采用Student′sttest 对两组样本进行显著性比较，采用One-way ANOVA 方差分析对3组及以上样本进行显著性比较，P＜ 0.05被认为具有统计学意义。

3 结 果

3.1 PD-L1表位肽疫苗的设计

选择中国人群常见的HLA I 类分型：HLA-A*02∶01、HLA-A*11∶01、HLA-A*24∶02 进行表位预测，获得了CTL 表位肽和线性B 表位肽，经过表位合并，设计了4个CTL表位肽和2个线性B表位肽，并与硝基化辅助T细胞表位连接，最终候选表位肽序列见表1。

3.2 基于HIS 小鼠检测PD-L1 表位肽的体液免疫活性

为了检测PD-L1-B表位肽的免疫原性，取首次免疫后第7、14、21、24 天的HIS 小鼠血清，使用ELISA 法检测抗体滴度验证B 表位肽的免疫原性。结果如图1-A 所示，从第14 天开始，PD-L1-B1 表位肽诱导产生了相较于溶剂对照组有显著性差异的PD-L1 特异性抗体（P ＜0.05），并且第21、24 天的抗体滴度进一步升高，但PD-L1-B2 表位肽未能成功诱导出PD-L1特异性抗体。

Table 1 Amino acid sequence of hPD-L1 epitope peptides

为了验证诱导产生的PD-L1-B1抗体能否和细胞表达的天然PD-L1受体结合，采用流式细胞术检测。选择PD-L1阳性表达细胞为靶细胞（本实验选择人A375 肿瘤细胞和小鼠B16F10 肿瘤细胞），加入HIS小鼠血清作为一抗，然后加入荧光标记的抗人IgG 二抗进行检测。结果如图1-B 所示，与对照组相比，设计的两款PD-L1-B 表位肽中，PD-L1-B1成功诱导出了PD-L1 特异性抗体，并能与人PD-L1阳性表达细胞A375 结合。研究还发现当以鼠PDL1 阳性表达细胞B16F10 为靶细胞时，HIS 小鼠血清中PD-L1 特异性抗体同样能够结合小鼠B16F10细胞上表达的PD-L1蛋白（图1-C）。

Figure 1 Immunogenicity of PD-L1-B epitope peptide and cross-reactivity of the PD-L1-B1 antiserum to native PD-L1 ( ± s, n = 3)A: Antibody titers produced after immunization of mice with PD-L1-B epitope peptide vaccine; B: Binding of PD-L1-B1 antiserum to human A375;C: Binding of PD-L1-B1 antiserum to mouse B16F10*P ＜ 0.05; ns:Not significant

3.3 基于HIS 小鼠检测PD-L1 表位肽的细胞免疫活性

序列分析发现，预测并设计的PD-L1-T2 表位肽包含于PD-L1-B1 表位肽中。为了验证PD-L1-B1 中的T2 表位肽是否能够诱导出针对T2 表位肽的肽特异性T 细胞，对HIS 小鼠进行PD-L1-B1 表位肽疫苗免疫。随后在IFN-γ EliSpot实验中，采用T2 短肽刺激脾脏淋巴细胞，结果如图2 所示。采用配对T 检验，加入T2 肽刺激后，斑点数显著增加，这表明PD-L1-B1 肽中的T2 肽能有效诱导出肽特异性T细胞。

3.4 PD-L1-B1表位肽疫苗的抗肿瘤活性评价

前面的免疫原性验证实验筛选并验证了PDL1 表位肽的免疫原性，发现PD-L1-B1 表位肽疫苗诱导的PD-L1 特异性抗体不仅能结合人PD-L1，还能与鼠PD-L1 结合，同时PD-L1-B1 还包含了一个验证有免疫原性的CTL 表位肽PD-L1-T2，因此选择PD-L1-B1表位肽，进一步探究其抗肿瘤活性。

为了评价PD-L1-B1 表位肽的抑瘤活性，在BALB/c小鼠中构建H22肝癌皮下移植瘤模型。抑瘤结果如图3-A，3-B所示，相较于溶剂对照组，PDL1-B1 表位肽显著抑制了肿瘤的生长［（757.3 ±376.2）mm3vs（1 978 ± 1 026）mm3，P ＜0.01）］，并且抑瘤效果不比PD-L1 蛋白疫苗差。在进一步评价PD-L1-B1 表位肽活性的实验中，分离了治疗后的小鼠脾脏淋巴细胞，首先通过IFN-γ Elispot评估了各组淋巴细胞的IFN-γ的分泌水平，然后通过流式细胞术检测了各组脾脏淋巴细胞的细胞杀伤毒性，统计结果分别如图3-C、3-D 所示。结果表明PD-L1-B1 表位肽免疫后显著增强了脾脏淋巴细胞的IFN-γ 分泌水平，同时其诱导的CTL 具有很高的体外杀伤活性，为（36.87 ± 3.43）%。相较于溶剂对照组，PD-L1-B1 组CTL 对靶细胞的杀伤活性有统计学差异（P ＜0.000 1）。

Figure 2 IFN-γ EliSpot responses against T2 epitope peptide in PD-L1-B1 ( ± s, n = 6)*P ＜ 0.05

Figure 3 Anti-tumor activity of PD-L1-B1 epitope peptide vaccineA: Tumor volume growth curve in mice after vaccine immunization (± s, n = 8-10); B: Tumor size in mice executed after vaccine treatment ( ± s, n =6); C: IFN-γ secretion levels in 5 × 105 spleen lymphocytes ( ± s, n = 6); D: In vitro killing toxicity of splenic lymphocytes after immunization ( ±s,n = 6)*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, ***P ＜ 0.001, ****P ＜ 0.000 1

3.5 肿瘤浸润淋巴细胞检测

为了分析PD-L1-B1表位肽疫苗治疗后对肿瘤微环境中肿瘤浸润淋巴细胞的影响，分别检测肿瘤组织中CD45+细胞、CD3+T 细胞、CD4+T 细胞、CD8+T细胞的浸润情况，结果如图4所示。与溶剂对照组相比，PD-L1-B1 表位肽疫苗接种显著增加了CD45+免疫细胞的肿瘤浸润数量（P ＜0.000 1）（图4-A），并且相对于溶剂对照组，PD-L1-B1 组诱导的T 淋巴细胞浸润水平显著提高（P ＜0.01）（图4-B）。进一步分析发现，PD-L1 蛋白和PD-L1-B1表位肽都提高CD4+T细胞的肿瘤浸润水平，但PDL1-B1组肿瘤浸润的CD4+T细胞比例更高，占比达到（59.48 ± 12.87）%，与溶剂对照组相比具有显著性差异（P ＜0.001）（图4-C）。最后相较于溶剂对照组，PD-L1-B1 表位肽诱导的CD8+T 细胞浸润水平显著提高（P ＜0.000 1）（图4-C）。

Figure 4 Detection of tumor-infiltrating lymphocytes in mouse tumor tissues ( ± s, n = 6)A: Proportion of infiltrating CD45+ cells in tumor tissue after immunization; B: Proportion of CD3+ T cells to CD45+ cells in tumors after immunization;C: Proportion of CD4+ T cells and CD8+ T cells to CD3+ T cells in tumors after immunization*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, ***P ＜ 0.001, ****P ＜ 0.000 1

3.6 肿瘤组织中相关蛋白的转录水平检测

为了进一步分析PD-L1-B1表位肽疫苗对肿瘤微环境的影响，检测了肿瘤组织中相关蛋白或者细胞因子的转录水平变化情况，结果如图5 所示。首先检测了肿瘤微环境中PD-L1的转录水平变化，发现相对于溶剂对照组，PD-L1-B1 组肿瘤组织中PD-L1 的mRNA 转录水平显著升高（P ＜0.01）（图5-A）。随后检测了具有抑瘤作用的IFN-γ 和TNFα 的转录水平变化（图5-B，图5-C），发现相较于溶剂对照组和PD-L1 组，PD-L1-B1 组肿瘤微环境中IFN-γ 和TNF-α 的mRNA 转录水平显著提高。此外，还检测了炎症因子IL-2 和IL-10 的转录水平变化情况，结果显示PD-L1-B1 组肿瘤组织免疫激活细胞因子IL-2 的mRNA 转录水平显著升高（P ＜0.001），而免疫抑制细胞因子IL-10 的mRNA 转录水平下降（P ＜0.01）（图5-D，图5-E）。

Figure 5 Detection of relevant proteins relative expression levels in tumor tissues by qRT-PCR ( ± s, n = 5)A: mRNA transcript levels of PD-L1; B: mRNA transcript levels of IFN-γ; C: mRNA transcript levels of TNF-α; D: mRNA transcript levels of IL-2;E: mRNA transcript levels of IL-10*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, ***P ＜ 0.001

4 讨 论

本研究以PD-L1 为靶点预测PD-L1 表位肽，并与硝基化辅助T 细胞表位连接设计成PD-L1 表位肽疫苗。抑瘤实验结果表明（图3），设计的PD-L1-B1 表位肽疫苗具有良好的抑瘤活性，治疗后的小鼠脾脏淋巴细胞具有显著的细胞杀伤活性，这表明以PD-L1为靶点设计表位肽疫苗是可行的。

PD-1/PD-L1 是肿瘤免疫疗法的理想靶点，目前国内上市的PD-1/PD-L1单克隆抗体已经达到15款。然而在大多数癌症类型中，由于缺乏预先存在的抗肿瘤CTL，大多数患者没有反应，也没有获得临床益处［11］。因此，能够诱导产生针对肿瘤抗原的CTL 的治疗性肿瘤疫苗可以提高患者对ICB的反应率。PD-L1可在大多数肿瘤中诱导表达，是致使肿瘤免疫逃逸的主要免疫检查点分子，目前的PD-1/PD-L1 ICB 适应症基本囊括主要癌症类型。在评价PD-L1-B1 表位肽抑瘤活性的实验中，发现PD-L1-B1表位肽疫苗治疗能够有效增加免疫细胞的肿瘤浸润数量。在连接硝基化辅助T 细胞表位的情况下，PD-L1-B1 表位肽组的肿瘤浸润CD4+T 细胞和CD8+T 细胞的浸润水平相较于溶剂对照组显著升高（图4-C）。在检测肿瘤组织中IFN-γ 和PD-L1 的mRNA 转录水平变化时，发现经PD-L1-B1 表位肽治疗后，IFN-γ 转录水平明显上升。相对应的，PD-L1 的转录水平也被检测到上升，与目前研究认为的IFN-γ 可诱导PD-L1 表达是一致的［22］。因此，针对PD-L1 的表位肽疫苗能够诱导肽特异性T细胞聚集到肿瘤组织中，分泌IFNγ 引发一系列抗肿瘤反应，而IFN-γ 还能够诱导肿瘤细胞表达PD-L1，PD-L1 特异性CTL 又能进一步识别并杀伤PD-L1阳性肿瘤细胞，发挥正反馈调节的作用。

针对肿瘤免疫逃逸机制的免疫检查点开发肿瘤疫苗提供了一种新的、可推广的策略。治疗性肿瘤肽疫苗是一种低副作用的疫苗接种方法，能以主动免疫的方式在体内诱导出针对肿瘤细胞的持久的特异性T 细胞反应［23］或者多克隆抗体反应［18］。在检测肿瘤组织中相关细胞因子的转录水平时发现，PD-L1-B1 表位肽疫苗治疗能够提高激活免疫的炎症因子转录，如IFN-γ、TNF-α、IL-2。IFN-γ 和TNF-α 被认为在抗肿瘤免疫中发挥了重要作用［24］，有研究发现肿瘤中同时表达IFN-γ 和PD-L1 的患者比单独表达IFN-γ 的患者具有更好的预后［25］。此外IL-2 除了具有促进T 细胞增殖作用外，还调节CD8+T 细胞效应和记忆反应［26］。同时，PD-L1-B1 表位肽疫苗还降低免疫抑制分子的表达，如IL-10。综上所述，PD-L1 表位肽疫苗可以重塑肿瘤免疫抑制微环境，使肿瘤微环境向免疫炎症方向转变。目前研究认为免疫炎症肿瘤（又称“热”肿瘤）特征是高T 细胞浸润、IFN-γ 信号增强、PD-L1 表达和高肿瘤突变负荷（TMB）［27］。因此，认为在PD-L1-B1表位肽疫苗的作用下，“冷”肿瘤有向“热”肿瘤转化的趋势。

综上所述，本研究筛选得到的PD-L1-B1 表位肽不仅能诱导产生PD-L1 特异性抗体和细胞毒性T 细胞，有效抑制肿瘤生长，还能增加肿瘤浸润CD8+T 细胞，重塑肿瘤免疫抑制微环境。因此，PD-L1-B1表位肽疫苗是一个有效的肿瘤免疫治疗候选分子，期待PD-L1-B1 表位肽疫苗联合ICB 或者其他免疫疗法在肿瘤临床治疗中的应用前景。