模式生物秀丽隐杆线虫在吸入麻醉药实验教学中的应用

崔梦侨 杨俊霞 王松山

吸入麻醉是全身麻醉的重要方法。吸入麻醉药对中枢神经系统具有广泛的抑制作用，使患者暂时丧失意识并达到镇痛和一定的肌松效果[1]。吸入麻醉药的作用机制至今仍未完全解明，目前认为吸入麻醉药在中枢神经系统内主要是通过抑制兴奋性突触传递和增强抑制性突触传递来发挥作用[2]。用于探究吸入麻醉药作用机制的动物模型多种多样，不仅局限于哺乳类动物，也包括模式生物秀丽隐杆线虫、果蝇、酵母等[3-7]。其中秀丽隐杆线虫在吸入麻醉药相关研究中有诸多优势：（1）易培养，繁殖速度快，产卵量大，生命周期短；（2）基因组与核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）信息库完整，和重要生命活动相关的基因与人类高度保守，并存在与人类相似的信号通路；（3）可通过正向遗传学筛选出麻醉药相关基因；（4）有完整的神经系统图谱，神经系统精细化程度高，能与外界环境信号（气味、光线、温度）的变化实时交互；（5）线虫及高等动物对吸入麻醉药的反应相似，提示可能存在相同的作用机制[8-10]。因此，系统掌握利用秀丽隐杆线虫研究吸入麻醉药作用机制，已经成为吸入麻醉药相关实验教学中不可或缺的一部分。文章基于以秀丽隐杆线虫为模式生物应用于吸入麻醉药作用机制的研究方法和研究策略，尝试构建可应用于本科生及研究生教学的吸入麻醉药实验内容，丰富吸入麻醉药的实验课程体系，为麻醉学的人才培养提供新思路、新方法。

1 秀丽隐杆线虫的生物学特性和培养方法

1.1 秀丽隐杆线虫的生物学特性

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C.elegans）是一种全身透明，生活在土壤中的以细菌为生的线形动物，其成虫体长1 mm 左右。秀丽隐杆线虫形态简单，呈蠕虫状，有雌雄同体和雄虫两种性别，常见的雌雄同体由959 个体细胞组成，而稀少的雄虫成虫由1 031 个体细胞组成，其中神经元细胞有302 个，具有明确的器官和组织结构。通常情况下，秀丽隐杆线虫雌雄同体自交，一生可产卵300 个左右。秀丽隐杆线虫生长周期短，平均3～4 d，而平均寿命约为20 d[11]。

1.2 秀丽隐杆线虫的实验室培养

秀丽隐杆线虫的培养温度16～25℃。正常线虫发育过程中，线虫产卵孵化后，会经历4 个幼虫期（Larvae 1-Larvae 4）。当生长密度过大或食物缺乏时，线虫会进入称为多尔阶段的幼虫期。这个时期的幼虫将停止发育，既能抵抗逆境，也不会衰老。此时期的线虫虫株可长期于-80℃低温保存，需要时可随时解冻复苏[8]。以秀丽隐杆线虫作为实验对象，通常将培养温度设置为20℃，线虫既可在固体琼脂板培养基中培养，也可在液体培养基中培养，并以尿嘧啶缺陷型大肠杆菌OP50 作为食物[12]。

2 秀丽隐杆线虫在吸入麻醉药实验教学中的应用

实验教学是通过理论联系实践，培养学生基本实验技能以及创新思维能力的重要途径。实验教学主要分为基础性实验教学、综合性实验教学及创新性实验教学。其中，由于学时的限制，实际实验教学中多采用验证性实验教学项目。下文将就这三种实验教学形式，简要阐述相应的以秀丽隐杆线虫为模式生物的实验方案，供授课教师参考。

2.1 秀丽隐杆线虫的运动能力测定

本实验为基础性实验（2～4 学时），为后续的吸入麻醉药对线虫的作用效果提供基本的检测方法。教师在实验教学中，可采用播放视频的方式，向学生展示秀丽隐杆线虫的基本运动方式，让学生有更直观的理解，以便后续观察时准确统计运动行为的变化。本实验适用于线形动物学等本科实验教学，也可用于麻醉药物实验的前期基础知识与技能的培训。

实验目的：以秀丽隐杆线虫为实验对象，学习使用体式显微镜进行活体生物的观察；掌握秀丽隐杆线虫的外部形态特征和基本运动方式。

实验方法简介：室温20℃条件下，在实验开始前24 h 用线虫挑针从食物丰富的琼脂培养皿中挑选10 只L4 晚期的线虫到新的培养皿中，1 个培养皿中放1只线虫（此操作可由教师完成）。实验当天测定时，轻轻地将培养皿放在体式显微镜观察范围内，以避免对线虫进行机械刺激。以下简要介绍秀丽隐杆线虫3 种运动的检测方法[13]：（1）线虫头部摆动频率：计时1 min，观察并记录线虫在1 min 内头部摆动的次数。秀丽隐杆线虫身体弯曲达到体长一半时记为1 次头部摆动；（2）线虫身体弯曲次数：计时3 min，并开始计算身体弯曲。以线虫咽管方向为Y 轴，线虫身体沿着X 轴方向上达到最大弯曲时，计为1 次身体弯曲。当线虫向前移动，然后自发地反转，并且咽部后面的区域再次弯曲到蠕虫向前移动时刚刚弯曲的方向，则不计数，待线虫继续向前运动且身体达到最大弯曲时再行计数。每只线虫重复计数3 次，并计算每只线虫每分钟的平均身体弯曲数；（3）线虫逆行行为试验：计时3 min，当线虫自发的向后移动时，计为1 次逆行行为。当线虫逆行后立刻发生急转运动，即观察到头部几乎碰到尾部或身体急转角度与反转时水平轴成135°时，计为1 次Omega 摆动。

2.2 异氟烷对秀丽隐杆线虫的麻醉作用观察

本实验为综合性实验（2～4 学时），观察不同浓度异氟烷吸入对秀丽隐杆线虫运动能力的影响。秀丽隐杆线虫停止运动（吸入麻醉药浓度高于临床浓度）[14]或运动迟缓、不协调（吸入麻醉药浓度接近临床浓度）[15]时作为麻醉终点。有研究表明，异氟烷暴露导致约50%的线虫不再对尖锐刺激做出反应的浓度为3%（vol%）。在秀丽隐杆线虫中，该浓度类似于手术麻醉平面的最低肺泡有效浓度（minimum alveolar concentration，MAC）水平。本实验还将设置4%和8%的异氟烷暴露浓度。4%的异氟烷为1.33 个MAC，代表适度的麻醉深度以达到对所有实验对象进行持续麻醉的效果。8%的异氟烷为2.66 个MAC，代表深度麻醉[3，16]。本实验可与3.1 的实验内容相结合，设置为综合性实验。

实验目的：以秀丽隐杆线虫为实验对象，学习使秀丽隐杆线虫暴露于吸入麻醉药的方法；掌握通过观察线虫的运动能力，确定线虫的麻醉终点对应的麻醉药物浓度。

实验简介：室温20℃条件下，在新的含有丰富食物的线虫琼脂培养基上滴30 μL 25%的漂白剂和10 mol NaCl 溶液的混合液（比例为4∶1），并将30 只左右健康成虫置于液滴中，对秀丽隐杆线虫进行均一化（此步骤可由教师完成）。均一化时间由预计暴露吸入麻醉药的线虫生长时期决定。例如，L1 幼虫期开始暴露，则均一化时间为实验开始前24 h；若从进入成虫期开始暴露，则均一化时间为实验开始前约60 h，时间根据教学实验需要自行安排。实验当天，将培养有均一化后线虫的琼脂板暴露在装有0%、3%、4%和8%异氟烷的密封盒中。通过观察线虫的运动能力，判断麻醉终点，记录对应的异氟烷浓度和时间。教师可参考该实验内容，灵活变换吸入麻醉药种类进行相同的实验，也可适当安排更多学时，对不同吸入麻醉药对秀丽隐杆线虫的麻醉效果进行比较。指导学生利用统计学方法和软件对得到的实验数据进行统计分析，获得吸入麻醉药对秀丽隐杆线虫麻醉的EC50。

2.3 不同吸入麻醉药对秀丽隐杆线虫细胞内ATP 水平的影响

本实验为综合性实验（2～4 学时），比较不同的吸入麻醉药对细胞内ATP 水平变化的调控作用。ATP 是细胞的主要能量“货币”，细胞内ATP 水平的降低会导致许多细胞活动发生故障，例如神经元活动。有研究表明，秀丽线虫吸入异氟烷后，细胞内ATP 水平发生显著下降[17-18]。以异氟烷吸入实验为参照，教师带领学生利用相同实验手段，探索其他几种临床常用吸入麻醉药对细胞内ATP 水平的影响。

实验目的：以秀丽隐杆线虫为实验对象，学习细胞内ATP 水平的检测方法；掌握不同吸入麻醉药对秀丽隐杆线虫细胞内ATP 水平的影响。

实验方法简介：室温20℃条件下，实验开始前5 d，对秀丽隐杆线虫进行均一化（此步骤可由教师完成）。实验当天，将培养有均一化后健康成虫的琼脂板分别暴露在装有空气（阴性对照组）、异氟烷（阳性对照组）或其他汽化麻醉剂（实验组）的密封盒中。临床常用的吸入麻醉药有氧化亚氮、恩氟烷、地氟烷、七氟烷等，教师可结合实际教学情况进行选择。实验时将吸入麻醉药使秀丽线虫停止运动作为麻醉终点。参考实验3.1 的几个判断线虫运动能力的指标，待线虫停止运动后，将处理过的线虫转移到含有50 μL S-basal（50 mM NaPi，0.1 M NaCl，pH 6.0）的1.5 mL 试管中。然后将试管在液氮中快速冷冻，取出后煮沸10 min，离心（15 000 g，10 min，4℃）取上清，使用荧光素酶测定试剂盒（CellTiter-Glo®2.0 Cell Viability Assay，Promega）对每种上清液进行三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）水平的测量。数据处理后，比较不同吸入麻醉药对线虫细胞内ATP 水平的影响。指导学生依据实验结果撰写实验报告。

2.4 不同吸入麻醉药对秀丽隐杆线虫的神经发育毒性作用

本实验为创新性实验（1 周），秀丽隐杆线虫在幼虫期暴露于不同的吸入麻醉药，观察其对线虫成年后神经发育的毒性作用。虽然吸入麻醉药被广泛应用于临床，但其对处于发育年龄并在发育阶段反复暴露于吸入麻醉药的神经毒性作用已引起关注。吸入麻醉药对神经发育的毒性作用主要包括神经细胞的死亡，神经递质传递异常及其引起的认知障碍和精神错乱等精神系统疾病[19-20]。本实验利用转基因线虫株unc-25：：GFP，该线虫株已广泛用于观察轴突再生的研究，在正常状态下，γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid，GABA）能运动神经元（6 个背侧「Dorsal D，DD」类和13 个腹侧「Ventral D，VD」类）将它们的轴突从腹侧神经索向背侧神经索周向投射，在腹侧神经突与其他运动神经元的神经突形成连接。神经发育受损的情况下，轴突延伸以及突触连接形成会出现异常[21]。以异氟烷吸入实验为参照，教师带领学生利用相同实验手段，探索其他几种临床常用吸入麻醉药的神经毒性作用。

实验目的：以秀丽隐杆线虫为实验对象，学习线虫轴突再生的观察方法；掌握不同吸入麻醉药对秀丽隐杆线虫神经元退行性病变的影响。

实验方法简介：室温20℃条件下，实验开始前，对秀丽隐杆线虫（转基因线虫株unc-25：：GFP）进行均一化（此步骤可由教师完成）。在健康幼虫的L1、L2、L3、L4 时期均暴露在装有空气（阴性对照组）和异氟烷（实验组）的密封盒中1 h。待线虫发育为成虫后，由教师带领学生利用荧光显微镜观察线虫DD 和VD 神经元形态学变化并进行拍照记录。数据处理后，比较不同吸入麻醉药对线虫轴突再生的影响。指导学生依据实验结果撰写实验报告。

2.5 敲低吸入麻醉药敏感性基因，观察麻醉药抗性及对神经递质释放的影响

本实验为创新性实验（1 周），观察线虫对吸入麻醉药的抗性及探讨吸入麻醉药抗性的机制。研究表明，吸入麻醉药的一个作用机制是抑制神经递质释放[22-23]。同时，研究人员发现抑制线虫体内神经递质释放会导致线虫对吸入麻醉药产生超敏反应[24]，而增加神经递质释放的突变体线虫株则对吸入麻醉药产生抗性[25]。目前，在线虫体内已发现的和麻醉药敏感性相关的基因有egl-30，unc-79，unc-80，unc-7，unc-8，unc-9，unc-1，unc-24，gas-1，unc-64，nca-1，nca-2 等[26]。教师通过带领学生在线虫体内敲低上述基因，并辅助神经递质释放相关转基因线虫株，观察线虫对吸入麻醉药的抗性及对神经递质释放的影响。

实验目的：以秀丽隐杆线虫为实验对象，学习利用RNA 干扰（RNA interference，RNAi）技术在线虫体内敲低目标基因；掌握线虫对吸入麻醉药敏感的基因。

实验简介：实验开始前，在线虫RNAi 文库中挑取egl-30，unc-79，unc-80，unc-7，unc-8，unc-9，unc-1，unc-24，gas-1，unc-64，nca-1，nca-2 基因的RNAi菌并在含氨苄青霉素和卡那霉素抗性的LB 固体培养基上培养。实验开始前1 天，在LB 液体培养基中过夜培养。实验当天在含有IPTG 诱导剂的琼脂板上铺菌，将L4 幼虫期SNB-1：：GFP 转基因线虫株挑取至IPTG 琼脂板上，待F1 L4 幼虫出现后，将琼脂板暴露在装有吸入麻醉剂的密封盒中，待对照组（铺有空载体菌液的琼脂板）达到麻醉终点，利用荧光显微镜观察各组线虫SNB-1 的表达情况。正常情况下，SNB-1 集中表达在秀丽隐杆线虫背侧和腹侧神经索中，与突触前蛋白共定位点状表达。对照组为线虫，在麻醉后，SNB-1 在秀丽隐杆线虫背侧和腹侧神经索中前突触处的点状表达减少，而对吸入麻醉药有抗性的线虫则与野生型SNB-1：：GFP 转基因线虫株中的SNB-1 表达情况一致[27]。该实验结果为开放性，上述敏感基因敲低后，线虫对不同吸入麻醉药表现出的抗性及对神经递质释放的影响需要学生探索及比较。该实验操作步骤多，实验周期较长，适合有助教参与的实验教学，以辅助学生顺利地完成全部实验。

3 总结与展望

本文仅从秀丽隐杆线虫行为学和生理学测试角度对以秀丽隐杆线虫为模式生物的教学方案进行设计。鉴于秀丽隐杆线虫是遗传学和分子生物学研究领域的重要模式动物，近年来以其为实验材料的组学研究也取得了长足的进步[28-29]。可以利用线虫的基因组、转录组、蛋白质组等信息，对吸入麻醉药的作用靶点、关键信号通路和神经环路进行分析，以揭示吸入麻醉药的作用机制。此外，七氟烷吸入会引起动物神经内分泌异常（体细胞作用），还会引起生殖细胞的表观遗传重编程（生殖细胞作用），对后代神经行为产生影响[30]。可以利用秀丽隐杆线虫基因易处理，生活周期短，繁殖力强等优势，采用表观遗传学技术对吸入麻醉药的代际效应进行探讨，进而对吸入麻醉药的毒理效应进行风险评估，揭示吸入麻醉药的毒理机理。上述研究内容均可丰富到现有的吸入麻醉药实验教学体系中来，既可简化内容，适用于本科生教学，也可作为研究生长期探索的实验课题。这些创新性的实验有利于培养学生的创造性思维和独立进行科学研究的能力。

综上所述，秀丽隐杆线虫作为生物学研究领域的一种重要的模式生物，是研究吸入麻醉药作用机制的优势物种。因此，引入和建立以秀丽隐杆线虫为实验对象的实验教学体系是切实可行的。本实验教学方案不仅是对现有吸入麻醉药实验教学内容的补充，同时也增加了应用性较强的综合性和探索性实验项目，使得实验内容更加多元化和个性化。内容安排上有适合低年级学生的基础性实验训练，也有以着重训练学生创新思维的综合性实验。教师可根据教学对象，由简入繁，循序渐进，并可酌情对实验内容进行个性化修改，以满足不同年级学生的授课需求。