Notch信号通路调控T细胞免疫在气道炎症性疾病中的作用

赵竞一，王俊阁

作者单位：100010 北京，首都医科大学附属北京中医医院耳鼻咽喉科

气道炎症性疾病是以气道炎症、气道阻塞和组织重塑为特征的感染性或变态反应性疾病，包括变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)、慢性鼻-鼻窦炎(chronic rhinosinusitis，CRS)、支气管哮喘(bronchial asthma，BA)、慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)等。气道炎症的发生机制较为复杂，迄今尚未完全阐明，已知多种炎症细胞、细胞因子以及信号转导途径共同参与其中。在气道炎症中有一系列的信号通路激活，如丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路、核因子激活的B细胞κ-轻链(nuclear factor-κB，NF-κB)信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/PKB)信号通路、Janus激酶/转录激活因子(Janus tyrosine kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)信号通路及Notch信号通路等，各自发挥多种分子生物学功能。其中Notch信号通路是一个高度保守的信号系统，能够调节细胞分化、运动和干细胞增殖等，决定细胞命运和组织形态，对脏器的形态和功能产生影响。T淋巴细胞作为气道炎症中机体免疫应答的重要组成部分，在对抗各种病原体中发挥重要的免疫作用，近年来关于Notch信号通路与T细胞之间相互作用的研究也逐渐深入，Notch信号在气道炎性疾病中的作用机制研究及靶向药物治疗成为一大热点。本文就Notch信号通路调控T细胞免疫在气道炎症性疾病中的研究进展进行综述。

1 Notch信号通路的组成与激活

1917年，由“遗传学之父”Thomas Hunt Morgan首先描述，突变体果蝇存在一种基因，其功能缺失会导致果蝇翅膀边缘出现缺刻(notch)，故而得名Notch基因。Notch基因编码一系列跨膜受体蛋白，后者构建包括Notch受体、Notch配体、CSL-DNA结合蛋白以及下游靶基因在内的信号传导通路，参与细胞生长、分化、凋亡甚至突变等重要环节，是决定细胞命运的重要基因[1]。

Notch受体为Ⅰ型跨膜蛋白，分为胞外域、跨膜蛋白和胞内域三部分，在哺乳动物中有4种类型(Notch1、Notch2、Notch3、Notch4)。胞外域为异二聚体蛋白，包含29～36个用于结合Notch配体的表皮生长因子样重复序列，以及3个富含半胱氨酸的重复序列和1个异二聚化结构域，用于阻止配体无关的信号传导。跨膜蛋白含有一个S3裂解位点。胞内域由随机结构域、锚蛋白重复序列、核定位信号、反式激活结构域及P序列组合而成[2]。Notch配体同样为Ⅰ型跨膜蛋白，分为Delta like(DLL1、DLL3、DLL4)和Jagged(JAG1、JAG2)两类，其N端为Notch受体结合和活化所必须的DSL(Delta/Serrate/Lag-2)基序，随后根据配体的种类具有不同数量的表皮生长因子样重复序列[3]。

Notch信号的激活和传导是一种即时通讯，通过配体-受体交互作用发挥功能。典型的传递途径是，Notch配体蛋白与受体胞外域结合后，经过弗林(furin)蛋白酶、金属蛋白酶及γ-分泌酶于S1～S3酶切位点的三步酶切过程，配体蛋白被切断并释放具有转录调节活性的胞内域，后者与重组结合蛋白Jκ(recombination signal sequence-binding protein Jκ，RBP-Jκ)结合，调控下游基因表达[4-5]。另外，Notch信号传导也可以通过非RBP-Jκ途径调节相关基因的表达。这两种从细胞表面受体到细胞核基因组的信号传递是直接的、线性的，没有信号级联放大的过程[6]。

2 Notch信号通路对T细胞的调控作用

Notch信号参与T细胞多阶段的发育和分化过程，调节细胞活化及免疫活动，对其发育和功能具有显著影响。

2.1 Notch信号调节T细胞分化

T细胞分化依赖Notch信号途径。在胸腺表达的Notch蛋白作用下初始T细胞发育为双阴性1细胞(double negative 1，DN1，CD44+CD25-CD4-CD8-)，继而增殖分化为双阴性2细胞(double negative 2，DN2，CD44+CD25+CD4-CD8-)并表达高水平CD25[7]。随着Notch信号的目的基因Hes1(hairy and enhancer of split 1)表达增加，DN2细胞的增殖逐渐减少并转化为DN3细胞(double negative 3，CD44-CD25+CD4-CD8-)，同时Gata3(GATA-binding protein 3)、Tcf7(transcription factor 7)、Runx1(RUNX family transcription factor 1)等重要T细胞基因在此阶段达到表达峰值。DN3细胞依据CD27表达量的高低，可分为DN3a和DN3b两种亚型(后者高表达CD27)，其DNA位点β、γ及δ重排后生成多种T细胞受体链(T cell receptor，TCR)，在Notch信号的参与下，通过β-选择及γδ -选择过程分化为对应的αβT细胞或γδT细胞[8]；同时DN3细胞向DN4细胞(double negative 4，CD44-CD25-CD4-CD8-)转化，随后在Notch信号诱导下DN4细胞向CD4+CD8+双阳性αβT细胞(double positive，DP)分化。其中CD4受体与MHC(major histocompatibility complex)Ⅱ型配体结合，促使DP向CD4+T细胞转化；CD8受体与MHC Ⅰ型配体结合，促使DP向CD8+T细胞转化，该步骤同样由Notch信号介导[9]。Notch分子在CD4+T细胞表面广泛分布，通过诱导Tbx2(T-box transcription factor 2)、Gata3、FOXP3(forkhead box protein P3)、ROR-γt(etinoic acid receptor-related orphan receptor γt)表达，使初始CD4+T细胞在外周接受抗原刺激后分化为T辅助细胞(Th)，包括Th1、Th2、Th17及T调节细胞(Treg)[10-12]，执行不同的防御功能以满足机体免疫反应的需要。值得注意的是，Notch信号在人类和小鼠中的作用并非完全一致，人类Notch信号可有效促进γδT细胞分化，而小鼠只有DN2细胞向γδT17细胞分化时由Notch-Hes1通路介导，其余亚型γδT细胞的分化不需要Notch信号参与[13]，这种现象可能与人类和小鼠胸腺中Notch配体的表达种类不同有关：小鼠胸腺表达Dll4，而人类胸腺内表达的是JAG2[14]。因此，基于小鼠模型的Notch信号研究成果向人类治疗途径转化时应注意两者之间的差异性。

2.2 Notch信号调节T细胞活化

Notch信号通路参与调节多种T细胞的活化。TCR被MHC复合体激活后，引起Notch受体释放胞内域[15]并进行细胞内信号传导，从而维持T细胞激活状态。例如，Notch1-RBP-Jκ-IL-7Rα通路可使小鼠γδT17细胞维持激活状态，持续造成组织损伤[16]。又如，Notch信号非经典途径可与雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)共同作用，激活PKB信号并保护线粒体功能，减轻细胞核损伤，从而维持T细胞的生存状态[17]。Vγ9Vδ2T细胞是人体外周血循环中主要的γδT细胞亚群，在抗炎、抗肿瘤活动中发挥重要作用，研究通过高通量转录组学发现，阻滞Notch信号可显著抑制Vγ9Vδ2T细胞激活，并下调与其杀伤功能相关的基因表达[18]。此外，树突状细胞通过Notch信号上调醛脱氢酶1家族成员A2(aldehyde dehydrogenase 1 family member a2，Aldh1a2)转录，增加维甲酸的合成，促进Th17细胞活化并调节Th17/Treg细胞数量平衡[19]。

2.3 Notch信号调节T细胞免疫功能

Notch信号对T细胞的功能发挥有重要的调节作用。TCR信号可激活Notch-RBP-Jκ经典信号通路，后者可通过NF-κB通路反馈调节T细胞的增殖并增加干扰素γ(interferon-gamma，IFN-γ)的释放，继而增强T细胞免疫活性[20]。另外，Notch信号可通过增强T细胞表面白细胞介素(interleukin，IL)-2受体CD25的表达，使T细胞结合更多的抗原并降低T细胞的反应阈值[21]。Notch信号可通过上调穿孔素和颗粒酶B的表达，增强CD8+T细胞的杀伤力[22]；研究发现在甲型H1N1流感患者中，Notch受体和配体的表达明显升高，信号通路的激活可增强病毒特异性CD8+T细胞的杀伤功能[23]。若抑制正常人外周血CD8+T细胞的Notch1信号通路，其IFN-γ、IL-2及颗粒酶B的释放将受到明显抑制[24]。若使用γ分泌酶抑制剂(gamma secretase inhibitor，GSI)抑制γδT细胞Notch信号通路，或敲除其Notch基因，则γδT细胞释放IFN-γ明显减少，且对于磷酸抗原和抗CD3抗体刺激的细胞反应性降低，细胞杀伤力减弱[15]。

3 气道炎症性疾病中以Notch信号调控T细胞为靶点的相关研究

3.1 变应性鼻炎

Notch信号在AR患者中高表达，其通路激活程度与特异性免疫球蛋白E(specific immunoglobulin E，sIgE)的水平呈正相关[25]。Notch1信号可下调转录因子FOXP3表达，从而抑制Treg细胞分化，并上调IL-6、IL-10的表达，最终促进变应性鼻炎发展，因此阻断Notch1信号通路是治疗AR的潜在途径[25-26]。研究发现采用卵清蛋白致敏小鼠后，通过GSI阻滞小鼠Notch信号，小鼠过敏样症状可明显缓解，外周血Th2细胞因子IL-4、IL-5及特异性IgE抗体水平下降，鼻黏膜嗜酸性粒细胞浸润及杯状细胞化生明显减轻，说明干预Notch信号对于AR的治疗具有重要价值[27-28]。AR中不同亚型Notch受体在存在功能差异，如致敏小鼠模型外周血单个核细胞中Notch1、Notch3、Notch4的蛋白表达明显高于正常对照组，而Notch2的表达较低[29]；有研究发现Notch2信号通路通过上调FOXP3表达，可促进Treg细胞的分化，显著抑制AR炎症反应[5]。中药治疗方面，研究表明单味中药及复方制剂均可影响Notch信号通路功能，明显抑制AR炎性因子水平，恢复T淋巴细胞亚群平衡[30-31]。

3.2 支气管哮喘

研究发现，BA模型小鼠Notch配体Jagged1、Dll4呈现过表达，后者使小鼠外周血Th17/Treg细胞比例升高，阻断Notch-Dll4信号通路对BA模型小鼠Th17细胞分化起到抑制作用[32]。小鼠中Notch1和Notch2可能是促进BA发病的主要信号通路，通过小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)分别阻断小鼠Notch1～Notch4信号，其中Notch1和Notch2被阻断后出现肺组织T细胞IL-4、IL-5表达降低，IFN-γ表达升高[33]。另外，BA模型小鼠Notch配体JAG1、JAG2的表达增加可能与气道炎症反应及黏膜重塑有关[34]，通过Notch1-Hes1信号通路可促进气道平滑肌细胞的增殖，从而加重气道的上皮下纤维化。Pyrin重组蛋白可通过下调Notch1-JAG1信号通路，减轻BA模型小鼠气道炎症及气道重塑[35]。因此，对于以气道重塑为核心的难治性哮喘，选择Notch信号通路抑制剂可能是一种新的治疗策略[36]。另外，Notch蛋白表达量与哮喘患者糖皮质激素治疗效果呈负相关，联合监测Notch1、Notch3表达水平有助于指导糖皮质激素药物的应用[37]。

3.3 慢性阻塞性肺病

COPD模型小鼠存在T细胞亚群失衡，以Th1、Th17等促炎细胞增多为主；同时Notch1蛋白及其下游Hes1 mRNA水平升高，且与T细胞亚群失衡相关[38]，表明Notch1信号通路与COPD关系密切。GSI部分阻断Notch1-Hes1通路可抑制Th1、Th17细胞分化，从而调节Th1/Th2、Th17/Treg细胞平衡[39]。2型固有淋巴细胞可通过Notch-Gata3信号通路促进Th2细胞分化，这可能是COPD急性加重的机制之一[40]。鼻病毒通过Notch3引起COPD小鼠持续性气道杯状细胞增生，阻断Notch3可下调黏蛋白基因表达，减轻鼻病毒引起的杯状细胞增生和分泌[41]。治疗方面，研究表明补肺益肾方通过上调微小RNA34a表达、下调Notch3及Hes1蛋白表达，可抑制COPD大鼠气道黏液分泌，改善COPD大鼠炎症反应及免疫功能失衡[42-43]。和厚朴酚通过抑制COPD小鼠脾T细胞Notch信号通路的激活，纠正了COPD小鼠Th1/Th2和Th17/Treg细胞的失衡，从而使肺功能得以改善[44]。

3.4 其他气道炎症性疾病

Notch信号通路在伴有息肉的慢性鼻窦炎、毛细支气管炎、支原体肺炎、病毒性肺炎、放射性肺炎及肺纤维化等疾病中均发挥重要作用。慢性鼻窦炎伴鼻息肉患者鼻黏膜上皮中Notch1/JAG1蛋白、IL-33表达增加，Notch1/JAG1通路激活可能抑制嗜酸性慢性鼻窦炎伴鼻息肉患者Treg细胞功能，导致Th2型炎性反应和嗜酸性粒细胞浸润加重[45-46]。通过毛细支气管炎模型大鼠研究发现，静脉注射GSI能够阻断Notch信号通路，并抑制其气道炎症反应[47]；临床研究表明GSI可降低呼吸道合胞病毒毛细支气管炎患儿外周血单个核细胞Gata3水平[48]；黄芩苷可能通过Notch通路纠正Th17/Treg失衡来发挥对细支气管炎的治疗作用[49]，说明阻断Notch信号通路可能对毛细支气管炎有潜在的治疗价值。支原体肺炎患儿Th17/Treg细胞比例失衡，肺功能下降，Notch信号通路表达增高，而后者可能干预Th17/Treg细胞分化，使Th17细胞因子IL-17等水平升高，参与支原体肺炎发生和进展[50]。中药清肺透邪方可以减轻肺炎支原体肺炎模型小鼠肺组织炎症，其机制可能与抑制肺组织Notch通路中Notch受体的表达有关[51]。姜黄素能够减轻脓毒症急性肺损伤大鼠的炎性反应，其机制可能与Notch2/Hes-1通路相关[42]。呼吸道合胞病毒感染人肺上皮细胞后，通过Notch1/Hes1信号通路促进IL-25的释放，并上调黏蛋白MUC5AC(mucin 5AC)表达，导致气道黏液高分泌，而姜黄素衍生物对此具有抑制效应[53]。养阴清肺方可显著下调放射性肺炎大鼠Notch1及JAG1蛋白表达，可能是其防治放射性肺炎发生发展的机制之一[54]。吴茱萸次碱可能通过抑制Notch1/eIF3a(eukaryotic translation initiation factor 3a)信号通路，减缓肺泡上皮细胞向间质细胞转化的进程，从而缓解博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化[55]。

4 总结与展望

Notch信号通路是T细胞重要的信号传导途径，广泛参与调控T细胞的分化、活化及免疫功能。Notch信号通过纠正Th1/Th2/Th17/Treg细胞失衡、上调细胞炎症因子和黏蛋白表达、促进气道组织重塑等方式，影响变应性鼻炎、支气管哮喘、慢性阻塞性肺病等多种气道炎症性疾病的发生和发展，阻断Notch信号或下调Notch蛋白表达可改善气道炎症状态和免疫功能紊乱。未来应进一步研究Notch信号通路作用于T细胞的途径和靶点，探究Notch信号通路对气道炎症的调节机制，制定气道炎症性疾病治疗和预防的新策略。