穿心莲内酯治疗口腔鳞状细胞癌的网络药理学分子机制探析

祁子麟

(湖北科技学院医学部,湖北 咸宁 437100)

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是全球癌症死亡的第六大原因,每年约560 000人发生并导致超过300 000人死亡[1]。手术、放疗、化疗或联合治疗对患者的生活质量造成巨大影响,可能会出现语言障碍、吞咽困难和面部重塑等情况[2]。

穿心莲内酯(andrographolide,AG)是穿心莲的主要成分,具有抗癌、抗炎、抗菌、抗HIV、抗动脉粥样硬化等作用[3-4]。有研究显示,穿心莲内酯可以通过抑制p300信号通路和VEGF通路的失活阻止COX-2表达和血管生成,从而对乳腺癌起到治疗作用[5];它也可以减少口腔癌干细胞的增殖和自我更新,抑制致癌性和增强放射敏感性[6]。

本研究通过网络药理学和分子对接技术,分析穿心莲内酯与口腔鳞状细胞癌之间的关联,识别新的生物标志物,以寻找潜在治疗靶基因,为穿心莲内酯在口腔鳞状细胞癌的临床治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 筛选穿心莲内酯作用靶点

在Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中检索“Andrographolide”得到穿心莲内酯的2D结构,并将它导入SwissTarget Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)获取其潜在治疗靶点。

1.2 筛选OSCC相关靶点

在Genecards数据库(https://www.genecards.org/)中检索“OSCC”,找到与OSCC相关的靶点。使用Venny在线网站(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)获得穿心莲内酯在OSCC中的相关靶点。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建

使用STRING数据库(https://cn.string-db.org/)构建药物-疾病共同靶点蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络图,将共同靶基因导入。

1.4 GO和KEGG通路分析

GO富集分析和KEGG通路分析DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)和KEGG(https://www.kegg.jp/)数据库,找到共同靶基因存在的生物功能。

1.5 筛选关键基因

使用Cytoscape软件的hubba插件得到共同靶基因中排名前十的关键基因,并构建药物—靶点—通路网络图。

1.6 分子对接

在RCSB PDB下载蛋白结构,Pubchem数据库下载穿心莲内酯2D结构,使用Openbabel软件将穿心莲内酯格式转换为“PDB”格式,使用AutoDock Vina软件进行加氢、加电子等操作,并用来分子对接,结合能最小的对接模型为标准,使用Pymol软件绘制可视图。

2 结 果

2.1 穿心莲内酯作用靶点

在Pubchem上获得穿心莲内酯的2D结构(图1),共获得100个穿心莲内酯的潜在作用靶点。

图1 穿心莲内酯2D结构图

2.2 穿心莲内酯与OSCC共同靶点的筛选

在Genecards数据中检索到OSCC有1990个靶点。在Venny网站上绘制韦恩图,得到31个共同靶点(图2)。

图2 穿心莲内酯与OSCC共同靶点

2.3 共同靶点PPI网络图

将共同靶基因导入STRING数据库(https://string-db.org/)构建PPI网络。Cytoscape软件可以直观分析共同靶基因之间的复杂关系(图3)。

图3 穿心莲内酯与OSCC共同靶基因PPI网络图

2.4 GO富集和KEGG通路分析

31个共同靶点GO富集显示,主要生物过程为蛋白磷酸化、磷酸化、含磷化合物代谢过程、细胞连接的正调节等(图4),主要细胞组分为细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物、胞质溶胶、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物等(图5),分子功能主要为蛋白激酶活性、磷酸转移酶活性、激酶活性等(图6)。

图4 共同靶基因的主要生物过程(BP) 图5 共同靶基因的主要细胞成分(CC)

图6 共同靶基因的分子功能(MF) 图7 共同靶基因的主要信号通路

31个共同靶点KEGG通路显示,这些靶点主要富集在PI3K-Akt信号通路、RIG-I样受体信号通路、TNF信号通路、癌症通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用等(图7)。

2.5 关键基因的筛选

将PPI网络图导入Cytoscape软件中,使用hubba插件获得排名前十的基因,分别为GSK3β、JAK2、KDR、MAPK1、MMP9、CDK4、CDK2、IL6、AR、CDK6。药物-靶点-通路图如图8。

图8 药物-靶点-通路图

2.6 穿心莲内酯与关键靶蛋白GSK3β和JAK2的分子对接

使用穿心莲内酯与GSK3β和JAK2分子进行分子对接。结果显示,穿心莲内酯与GSK3β 分子对接结合能为-9.00kcal/mol(图9),与JAK2分子对接结合能为-8.5kcal/mol(图10),结合能均为负值,充分表示穿心莲内酯和GSK3β、JAK2分子自发结合。通常与受体结合能越低,结合的构象越稳定。

图9 穿心莲内酯与关键靶蛋白GSK3β的分子对接 图10 穿心莲内酯与关键靶蛋白JAK2的分子对接

3 讨 论

有研究表明[7],100μmol/L浓度的穿心莲内酯对口腔鳞癌细胞有显著的抑制作用,并能诱导细胞凋亡。也有研究表示[8],穿心莲内酯是用于治疗口腔癌的潜在化合物。虽然很多研究都可以证明穿心莲内酯对口腔鳞状细胞癌有治疗作用,但是其潜在的分子机制尚不明确。网络药理学是识别草药替代靶点的有力工具,在促进新药开发和评估其安全性方面具有优势[9-10]。因此,我们运用网络药理学分析穿心莲内酯与口腔鳞状细胞癌之间的关联,探索两者之间潜在的分子机制。

本研究分别找到穿心莲内酯和口腔鳞状细胞癌的潜在作用靶点,通过韦恩图交集后得到31个共同靶点,最后PPI网络图筛选出穿心莲内酯作用于口腔鳞状细胞癌排名前十的重要枢纽基因,分别为GSK3β、JAK2、KDR、MAPK1、MMP9、CDK4、CDK2、IL6、AR、CDK6。GSK3β是糖原合酶激酶3β,它可以通过下调GSK3β的表达从而抑制口腔鳞状细胞癌的细胞增殖[11]。也有研究证实[12],GSK3β与口腔鳞状细胞癌密切相关,在活检中高度表达。JAK2是酪氨酸蛋白激酶,甘草查耳酮H可以通过调控JAK2从而抑制口腔鳞状细胞癌的细胞生长,并诱导细胞凋亡[13]。KDR是血管内皮生长因子受体,实验中检测到口腔鳞状细胞癌的特异性为100%,敏感性为70%,因此,它可以作为早期检测口腔鳞状细胞癌的生物标志物[14]。MMP9是基质金属蛋白酶,当在口腔鳞癌的组织学阴性手术切缘中检测到MMP9时,它可作为肿瘤复发的预测因子[15]。也有数据表明[16]MMP9通过调节其亲本基因的信使RNA稳定,在口腔鳞状细胞癌中起到促进转移基因的作用。IL6是白细胞介素,IL6抗体治疗在体外和体内动物模型中完全抑制了口腔癌细胞的骨侵袭[17],并且增加口腔和口咽癌患者的血清和唾液中IL6表达[18-20]。以上研究结果表明,上述基因可能是穿心莲内酯治疗口腔鳞状细胞癌的潜在作用靶点。

通过对穿心莲内酯和口腔鳞状细胞癌的31个共同靶基因的KEGG通路分析结果显示,共同靶基因主要与PI3K-Akt信号通路、RIG-I样受体信号通路、TNF信号通路、癌症通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用等有关。研究显示[21],敲除SPP1基因通过PI3K-Akt信号通路可以促进OSCC细胞凋亡,且EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药与顺铂的获得性耐药有很大的关系,从而促进OSCC细胞的凋亡。RIG-I样受体信号通路已被验证在白斑到OSCC的过程中也会发生作用[22]。这些研究也证实了我们KEGG通路富集的结果。

最后从十个关键靶基因GSK3β、JAK2、KDR、MAPK1、MMP9、CDK4、CDK2、IL6、AR、CDK6中筛选出两个基因,即GSK3β和JAK2。让穿心莲内酯与关键靶点GSK3β和JAK2进行分子对接,结果显示,穿心莲内酯与相对应的作用靶点GSK3β和JAK2均有较好的亲和力和结合力,从而验证了本研究预测的准确性,说明了这些基因是穿心莲内酯治疗口腔鳞状细胞癌的作用关键点。

综上所述,本研究运用网络药理学,通过对穿心莲内酯抗口腔鳞状细胞癌作用靶点的GO富集和KEGG通路分析,筛选关键靶基因,以及用穿心莲内酯与关键靶点进行分子对接,明确了穿心莲内酯治疗口腔鳞状细胞癌的分子机制,为穿心莲内酯扩宽了药用价值,也为口腔鳞癌细胞的治疗提供了新的研究思路。