免疫性肝损伤实验动物模型概述

黄 婷,闵 清,2*

(1.湖北科技学院医学部药学院,湖北 咸宁 437100;2.鄂南特色中药湖北省工程研究中心)

肝脏是机体进行生物转化最主要的器官,参与人体的各项生命活动及物质、能量代谢,持续性的肝损伤会导致肝纤维化及肝硬化,使肝功能衰竭,甚至可能发展为肝癌。随着人们生活方式的改变,长期饮酒、熬夜、过劳等不良习惯使得患有肝脏损伤的人群比例不断提高,肝损伤成了当前肝脏疾病研究的热点问题之一[1]。动物模型的建立是疾病研究与药物研发过程中的重要环节,建立与临床肝损伤相似病理机制的实验性动物模型,有利于进一步的深入研究免疫性肝损伤的发病机制,筛选保肝的临床药物,探索有效治疗手段。本文介绍了免疫性肝损伤的特点及机制,阐述免疫性肝损伤的造模方法及机制,旨在更深入了解免疫性肝损伤模型的研究进展,为免疫性肝损伤的相关研究提供参考依据。

1 免疫性肝损伤

免疫性肝损伤(immune liver injury,ILI)是一种进行性的、慢性炎症性肝病,与界面性肝炎、血浆肝酶升高、肝小叶结构紊乱、自身抗体的存在和调节性T细胞(Tregs)功能障碍有关[2]。ILI波及各个年龄阶段与种族,常见于中老年女性[3]。由于其呈现的炎症以多个效应免疫细胞的环境动态变化为特征,所以病程表现有急有缓,最终发展为肝纤维化与肝硬化。

ILI是一种复杂的多因素、多基因疾病,由遗传易感的触发因素和环境之间互相作用引起。其免疫发病机制依赖于自身反应性的CD4+和CD8+T细胞,在环境的刺激下,自身肝脏抗原的耐受性丧失[4],诱发ILI。ILI又可以根据其血清特征分为两种亚型:1型(AIH-1)以抗核抗体(ANA)、抗平滑肌抗体(SMA)、抗中性粒细胞胞浆抗体核周型(p-ANCA)为特征;2型(AIH-2)以抗肝肾微粒体抗体1型(anti-LKM1)、抗肝细胞质抗体1型(anti-LC1)为特征[5]。AIH的诊断在临床上无明确标准,一般以肝脏活检发生组织学异常、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)升高为依据。在治疗上,采用类固醇等免疫疗法缓解症状,控制生化指标,阻止疾病的继续发展。

2 ILI动物模型的建立

2.1 刀豆蛋白A(concanavalin A,Con A)

Con A是一种从矮刀豆中提取出来的凝集素,被广泛应用于建立免疫介导的小鼠肝损伤模型中。采用Con A建立ILI动物模型的方法简单、方便,重复性好,且建立的动物模型在组织学特征与血清特征上与人类ILI患者具有很高的相似性[6]。

Con A诱导ILI的机制与T细胞和巨噬细胞的激活有关。研究发现[6],Con A的诱导可以激活Kuffer细胞(KC)分泌大量的IFN-γ、TNF-α、IL-1和IL-2等炎性细胞因子,激活CD4+T淋巴细胞(Th)。同时,还与其他多种免疫细胞、肝非核细胞与肝细胞损伤的发展有关,包括CD8+T淋巴细胞(CTL)[7]、自然杀伤T淋巴细胞(NKT)[8]、中性粒细胞[9]和窦内皮细胞(SEC)[10]。Con A不仅能够附着在KC上表达主要组织相容性Ⅱ类复合物(MHC),还可以与SEC、KC、中性粒细胞表面的甘露糖受体(MRs)相结合[11]。Con A通过MRs激活巨噬细胞,增加超氧阴离子的释放,诱导细胞因子的合成,这些细胞因子以直接或间接的方式参与肝脏损伤。

在建立Con A诱导的小鼠肝损伤模型中,一次性尾静脉注射Con A 1.5～40mg/只,在8h内就可以观察到血清肝功能指标AST、ALT、细胞因子水平及组织学上会出现不同程度的特异性肝损伤,而且呈剂量依赖性,当剂量大于50mg/kg时,会使实验小鼠发生死亡,腹腔注射无法建立肝损伤模型[12]。

2.2 脂多糖(LPS)

脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)又名内毒素,是大多数革兰阴性细菌细胞壁的磷脂成分,同时也是免疫系统中最有效的诱导剂之一。完整的LPS分子由O-特异性侧链(O-specificside chain)、核心多糖(core polysaccharide)、脂质A(lipid A)三部分组成,其中脂质A是LPS中刺激免疫系统最核心的部分[13]。当LPS进入血液时可能诱发内毒素血症[14],造成多器官功能衰竭;LPS刺激免疫系统时造成免疫失调,产生炎症损伤的同时,还会诱导产生神经退行性疾病[15]、代谢性疾病[16]和心血管疾病[17]等慢性、进行性疾病。

LPS主要通过Toll样受体4(toll like receptor 4,TLR4)依赖性和非TLR4依赖性两种途径诱导严重的炎症反应。在TLR4依赖途径中,LPS先与脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein,LBP)结合后再与CD14受体结合,转移到TLR4-MD2复合物上后被识别,随后TLR4-MD2复合物二聚化引起MYDD88、NF-κB、TRIF等信号表达,刺激白细胞释放IL-1β、TNF-α、IL-6等[18]。除激活白细胞释放各种炎症介质外,LPS还参与免疫反应的其他方面,例如促进树突状细胞成熟和迁移,将自然免疫与适应性免疫相结合[19],并通过p38 MAPK依赖性TLR4信号传导在巨噬细胞中促进自噬[20]。LPS通过TLR4介导巨噬细胞中NADPH氧化酶激活[21],导致活性氧(ROS)和氮(如NO)的产生,诱导炎症损伤的发生。

利用LPS建立自身免疫性肝损伤动物模型时,可以单独注射LPS或与卡介苗(bacillus calmette,BCG)、D-氨基半乳糖(D-galactosamine,D-Gal N)、死亡菌体联合。

2.2.1 单独使用LPS

单独使用LPS建立免疫性肝损伤模型时可以采用腹腔注射与尾静脉注射两种方式。腹腔注射时一般采用一次性大剂量注射的方式,给予4～10mg/kg LPS在24h后可以观察到组织学及组织中炎症因子的变化[22]。腹腔注射的方法简单方便,但死亡率高,一般作为急性肝损伤模型的建立方式。间断小剂量尾静脉注射的方式死亡率低,连续给予尾静脉注射0.2mg/kg LPS,4周即可建立慢性损伤模型[23]。

2.2.2 BCG+LPS

卡介苗(BCG)具有免疫调节作用,感染小鼠后能够激活肝脏中的T淋巴细胞。BCG进入血液后会引起大量致敏KC及巨噬细胞聚集到肝脏,同时抗原被提呈给特异性T淋巴细胞,肉芽肿形成,肝实质被破坏,再次注射小剂量的LPS时,LPS会进一步刺激巨噬细胞和KC,引起大量的ROS,细胞毒性因子NO,炎性因子TNF-α、IL-1β释放,肝细胞受到急性损伤[23]。

BCG+LPS诱导肝损伤模型需要先尾静脉注射2.5mg BCG,约含5.0×107活菌,11或12d后尾静脉注射LPS 80μg,8～12h后可见血清ALT、AST和白介素等炎症因子水平上升,组织观察肝脏炎性浸润[24]。模型中的病理过程类似于人类肝中KC等非特异性免疫细胞浸润,释放炎症因子损肝脏的过程,更加适用于人类免疫性肝损伤的研究。

2.2.3 D-Gal N+LPS

D-Gal N又称半乳糖胺或软骨糖胺,广泛存在于糖、糖蛋白和糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)中。D-Gal N对细胞有毒性作用,主要通过夺获尿苷三磷酸(UTP)、抑制蛋白质的合成损伤肝细胞。与LPS合用时,D-Gal N可以提高小鼠对LPS的敏感性,从而降低脂多糖的使用量,诱导肝细胞凋亡损伤,而不产生全身性的炎症。建立D-Gal N+LPS诱导的肝损伤模型时,采用腹腔注射的方法,注射LPS 0.4～50mg/kg、D-Gal N 400～800mg/kg,6h后可以观察到肝损伤有关指标的变化[25]。

2.2.4 死亡菌体联合LPS

Ferluga和Allison在1978年发现了小鼠在注射了加热的短棒杆菌(corynebacteriumparvum)后,可以引起肝小叶浸润大量的单核吞噬细胞,再次注射脂多糖后会导致致命性的肝炎[26]。该模型病理机制与人体的重症肝炎类似,但由于死亡率较高,在21世纪后已较少使用。

短棒杆菌与LPS合用时,首先注射短棒杆菌,引起肝脏中大量单核吞噬细胞浸润,巨噬细胞增生、活化、吞噬功能增强;再次注射LPS后,进一步激活肝窦中的枯否细胞,诱导释放大量的细胞因子如TNF-α、IFN-γ等,从而诱发急性肝炎[27]。

2.3 异种血清

异种血清作为异体抗原刺激实验动物后,激活体内的B淋巴细胞,产生免疫应答,形成免疫复合物(IC),而后激活相应抗体来进行免疫清除。若异种血清没有被及时清除,一直刺激机体,则会在模型动物体内的肝小叶动脉中产生纤维素样坏死,汇管、肝窦、血管壁上均有IC沉着,继而引起Ⅲ型变态反应,异种白蛋白会激发静止的贮脂细胞增生,并向肌成纤维细胞转化,导致肝细胞坏死及组织损伤,进而分泌胶原,最后形成肝纤维化[28]。

采用异种血清建立肝损伤动物模型时,常选用人血清白蛋白、牛血清等,通过腹腔、皮下或尾静脉多次注射制备模型。将人血清白蛋白用生理盐水稀释,与等量的完全弗氏佐剂乳化后进行皮下多点注射,每次注射白蛋白4mg,共4次,然后尾静脉注射白蛋白。在电镜下观察,早期可见贮脂细胞增生、活跃,后期见肌成纤维细胞形成,分布于汇管区,周围沉积大量胶原[29]。该模型制备简单、经济,模型稳定,肝细胞损伤较轻,无碎屑状或桥状坏死,可为各种慢性免疫性肝损伤相关疾病的研究提供实验动物模型。

2.4 聚肌苷酸胞苷酸(polyinosinicpolycytidylicacid,PoliI:C)

聚肌苷酸胞苷酸是Toll样受体3(toll like receptor3,TLR3)的配体,能够通过激活TLR3分子相关的信号通路来引发下游的免疫应答[30],在自身免疫性疾病的发生、发展中发挥重要的生物学作用。PoliI:C的结构与双链病毒RNA类似,所以由其引起的免疫反应相似于病毒感染[41]。PoliI:C是肝脏NK细胞强有力的激活剂,可以募集大量的肝脏NK细胞迁移至肝脏内,高度活化并增强其免疫功能。PoliI:C通过激活并增强NK细胞的杀伤作用,在肿瘤坏死因子(TNF)相关的凋亡诱导配体(TRAIL)及诱生的α干扰素(INF-α)、γ干扰素(INF-γ)和白细胞介素12(IL-12)等细胞因子介导下,可以诱发肝脏轻度的炎症反应,引起肝细胞的实质损伤[42]。

PoliI:C诱导肝损伤模型需要通过腹腔注射5～20μg/g的PoliI:C,注射后18～24h内血清ALT和AST明显升高[33]。也可选用C57BL/6小鼠同时注射PoliI:C和D-Gal N,建立免疫性肝损伤的模型,给药时尾静脉注射poliI:C(75μg/kg),腹腔注射D-Gal N(500mg/kg),12h后可见血清ALT、AST水平上升,显微镜下可观察到肝脏组织肝小叶坏死、免疫细胞浸润及肝细胞膨胀、坏死和裂解等现象[34]。

2.5 基因工程改造

随着基因工程技术的发展,特定基因敲除小鼠、转基因小鼠、人源化小鼠等经过基因修饰、改造的小鼠模型,已经成为建立免疫性肝损伤模型,研究肝病发生发展、药物筛选与评价研究的重要的重要工具[35]。

目前,有几种转基因小鼠模型其发病症状与人类ILI非常相似[36]。将白蛋白(Alb)-cre转基因小鼠、诱导型白喉毒素受体(DTR)转基因小鼠和严重联合免疫缺陷(SCID)-小鼠杂交,建立Alb-cre/DTR/SCID-beige(ADSB)转基因小鼠,腹腔注射白喉毒素(DT)4d后出现肝损伤,移植人肝细胞30d后小鼠肝脏出现了Kupffer细胞[37]。NTxPD-1/-转基因小鼠模型则是另一类转基因小鼠,该小鼠基于编码程序性死亡受体1(PD-1)的基因被敲除,新生小鼠接受胸腺切除术,以显著减少调节性T细胞的数量实质被CD4+和CD8+T细胞浸润,出现小叶坏死,并在出生后第3周左右发生致命的肝炎[38]。此外,还有不表达Tyro3、Axl和Mer酪氨酸激酶基因的TAM-/-模型小鼠[30],对TLR3的细胞内信号通路进行负向调节,TLR3途径被过度激活,随后释放促炎症细胞因子,TAM-/-小鼠出现肝炎、血清转氨酶活性升高、门静脉炎症和坏死。

2.6 其他

随着对ILI的研究不断深入,建立ILI小鼠模型的方法也不断更新,除以上常见方法外,还可以通过注射三氯乙烯[39]、半乳糖凝集素等建立ILI小鼠模型;三氯乙烯通过诱导产生CD4+T细胞依赖的ILI[40];半乳糖凝集素是一种从茶树菇中提取的化合物,其作用机制与Con A类似;酒精也可以通过诱导肝脏氧化应激损伤,增加肠源性内毒素,从而通过多种途径激活KC诱发ILI。

3 小结与展望

不同的ILI模型建立方法具有不同的损伤特点,也为当前不同发病机制、症状以及相关药物的研究与筛选提供重要工具。其中,Con A与BCG+LPS诱导的ILI模型建立简单、稳定,发病机制与人类ILI最为相似,是最常见、应用最多的损伤模型。尾静脉注射LPS诱导的模型死亡率低,发病机制与慢性炎症损伤相似,为慢性免疫性炎症损伤的相关研究提供了较好的实验动物模型,但由于时间长,当前应用较少。异种血清、PoliI:C诱导的小鼠模型简便易行,应用于自身免疫性肝病与病毒性肝炎的相关研究。基因工程改造的小鼠与人类相似性最大,还可以建立人源性模型,为深入研究免疫性肝病的病理机制提供了新途径,也是今后动物模型研究和发展的重要方向。

疾病的发生、发展都具有复杂性,人与动物之间也存在种属差别,所以当前单一化的动物实验模型无法完全模拟人体中肝脏损伤完整的病理过程。在今后更应该从人类肝损伤的免疫病理机制出发,同时,充分考虑模型的重现性以及稳定性、经济成本等因素,建立与人类发病机制更加相似、具有阶段性与靶点性的动物模型,为今后免疫性肝损伤的相关研究奠定基础。