不同激素处理对红颜草莓茎尖萌发和增殖的影响

黄 敏，宁 眺,2，鲁峻宏，刘凯丽，袁崇峰，于德嘉，靳 松,2，李 晶,2,4

（1.昆明学院农学与生命科学学院，云南 昆明 650214；2.昆明学院云南省高校都市型现代农业工程研究中心，云南 昆明 650214；3.西南林业大学，云南 昆明 650224；4.香格里拉市藏美农业科技有限公司，云南 香格里拉 674400）

0 引言

草莓是蔷薇科草莓属的多年生草本植物，原产于南美，20 世纪初传入中国[1-2]。草莓种植面积和产量在浆果类水果生产中仅次于葡萄，2020 年我国草莓种植面积已达13.16 万hm2，产量也增至344.9 万t，呈逐年增长的趋势[3]。红颜草莓是日本品种，于1999 年引入我国[4]。尽管红颜草莓不耐热、不耐湿，但该品种繁殖能力和结果能力强，特别是在云南的气候条件下，甚至可以结4 茬果实，其果实在成熟后不仅颜色诱人且香味浓，因此在我国各地均有栽培，日渐成为云南省的主栽品种。

草莓传统的繁殖方法一般是匍匐茎繁殖，但此法会加大草莓携带病毒的可能，因而造成草莓果实品质下降[5-6]。采取组织培养的方式培育草莓苗，更经济有效且能快速地繁殖大量高质量草莓种苗，同时有利于品种资源保存[7]。经过组织培养培育得到的草莓苗在田间表现上也比匍匐茎繁殖的种苗更好。目前，草莓组织培养可分为茎尖分生组织培养、叶片组织培养、花药和花粉组织培养及原生质体组织培养等[8]。茎尖分生组织培养和花药培养都是草莓脱毒微繁途径，但草莓花药愈伤分化能力较茎尖分生组织低，培育耗时更长。因此，在组织培养育苗上，更多采取茎尖分生组织脱毒方式进行，组织培养育苗已逐渐成为生产草莓苗主要的来源之一[9]。

迄今为止，我国在草莓组培方面也取得了不少成果，无论是品种繁育方面还是种质资源保存上都取得了突出进展[8]。在草莓组织培养过程中，培养基和激素的选择十分重要，两者之间的合理搭配是决定组培是否成功的关键。值得注意的是，草莓体内的激素含量因不同品种和不同生长阶段而有所差异，因此在进行组织培养时对人工添加的激素种类和浓度要求也不同。有研究者对红颜草莓茎尖组织培养进行了探究，但不同的研究得出的结果均不相同[10-11]。研究者在进行草莓组织培养时采用的外源激素多为6-苄基嘌呤（6-BA）、吲哚乙酸（IAA）和萘乙酸（NAA）等[12-17]。本研究外源激素选取赤霉素（GA3）、6-糠氨基嘌呤（KT）等，探究不同外源激素的组合对红颜草莓茎尖组织培养的初代萌发及继代增殖情况等的影响，以期为红颜草莓茎尖组织培养提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试验地点

（1）试验材料。红颜草莓匍匐茎茎尖采自昆明学院农学与生命科学学院玻璃温室大棚；MS 培养基（不含琼脂和蔗糖）采购自青岛海博生物科技有限责任公司；琼脂、白糖、无水乙醇、75%酒精、0.1%升汞、氢氧化钠、盐酸和各种植物生长激素等由昆明学院农学与生命科学学院组培室提供。

（2）试验地点。昆明学院农学楼组培室。

（3）仪器设备。烧杯、量筒、玻璃棒、超净工作台、无菌盘、镊子、接种刀、无菌布、高压灭菌锅及组培玻璃瓶等。

（4）培养条件。光照度 2 000～2 500 lx，时间10 h/d，温度（25±2）°C，湿度 70%～80%。此外，试验中如不作特殊情况说明，所有培养基中添加MS 4.74 g/L，糖为30.00 g/L，琼脂为6.80 g/L，pH 值为5.8。

1.2 方法

1.2.1 外植体不同消毒处理

选取新鲜采取的红颜草莓匍匐茎的茎尖于流水冲洗30～120 min，在超净工作台上，分别用75%酒精消毒不同时间，无菌水冲洗3 次，再用0.1%升汞消毒不同时间，无菌水冲洗5 次 ，2 次消毒后无菌水冲洗时间均为30～50 s，将消毒后的茎尖放于接种盘上适当晾干水分，随后迅速接种到培养基中。20 d 后观察记录成活、污染及褐化情况。试验方案如表1 所示。

表1 不同消毒时间组合试验设计方案Tab.1 Experimental design scheme for different disinfection time combinations

1.2.2 初代萌芽培养基筛选

以MS 为基本培养基，在培养基中再添加不同浓度的6-BA、NAA 和GA3植物激素进行茎尖萌芽培养。将红颜草莓匍匐茎的茎尖于流水冲洗至少30 min；在超净工作台上，分别用75%酒精消毒30 s，无菌水冲洗3 次，每次30～50 s；再用0.1%升汞消毒10 min，无菌水冲洗5 次，每次冲洗30～50 s；然后将消毒后的茎尖放于接种盘上适当晾干水分，随后迅速接种到培养基中。每个处理接种10 瓶，每瓶2 根，重复3 次，共9 个处理。诱导培养30 d 后，观察统计茎尖萌发、褐化和污染情况。培养期间每天观察茎尖生长情况，及时挑出污染苗并做好记录。试验方案如表2 所示。

表2 初代萌芽培养基配方试验设计方案Tab.2 Experimental design plan for formulation of primary sprouting culture medium

1.2.3 继代增殖培养基筛选

增殖培养时，同样以MS 为基本培养基，然后添加不同浓度的激素6-BA、KT、3-吲哚丁酸（I3BA）进行增殖培养。在进行继代培养接种时，将草莓苗于超净工作台进行转接，尽量选取生长情况较一致的组培苗转接入不同激素浓度的继代培养基中。每处理接种10 瓶，每瓶2 根，重复3 次。培育30～45 d 后，观察统计草莓苗增殖情况。培养期间每天观察草莓苗生长情况，及时挑出污染苗并做好记录。试验方案如表3所示。

表3 继代增殖培养基配方试验设计方案Tab.3 Experimental design plan for formulation of subculture medium

1.2.4 计算

试验有关数据按以下公式计算。

污染率=（污染个数/接种个数）×100%

褐化率=（褐化个数/接种个数）×100%

萌芽（成活）率=（萌芽个数/接种个数）×100%

增殖系数=增殖分化总数/接入总数

1.3 数据分析

数据采用SPSS 22.0 软件和Excel 进行数据处理、显著性比较及分析。

2 结果与分析

2.1 不同消毒时间组合对茎尖消毒效果的影响

由表4 可知，不同消毒时间组合对草莓茎尖消毒的效果不同。从成活率来看，9 个处理的成活率为33.33%～83.33%，其中T5处理与其余各处理间均存在差异且差异极显著（P＜0.005），成活率最高为83.33%；T2处理与T6处理成活率较低，两者成活率仅为33.33%。从污染率来看，T5处理污染率最低为6.67%，T8处理污染率最高为33.33%，剩余各处理污染率为10.00%～30.00%。从褐化率来看，T8处理与各个处理间均存在差异且差异极显著（P＜0.005），并且T8处理没有褐化情况出现，而T2褐化率最高为40.00%。

表4 不同消毒时间组合对草莓茎尖的影响Tab.4 Effect of different disinfection time on strawberry shoot-tip

综上所述，T5处理成活率最高、污染率最低且褐化率也仅次于T8处理，所以红颜草莓茎尖最佳的消毒时间组合即为75%酒精消毒30 s，而后再用0.1%升汞消毒10 min。

2.2 不同培养基配方对初代萌芽效果的影响

由表5 可知，在培养基中不同激素浓度配比对草莓茎尖萌芽有不同的影响。S7、S8和S9处理在萌芽上与其余处理间均存在一定的差异，并且3 组处理萌芽率都高达100%；此外，S5处理萌芽率较其他处理都更低，萌芽率为63.33%，剩余处理萌芽率为70.00%～86.67%。从初代萌芽培养污染率方面来看，S2、S3、S4和S5处理污染率都为6.67%，其余处理没有污染情况，总体上9 组处理污染率都较低，进而验证了消毒方案的可实施性。在褐化率上，S5处理褐化率最高为30.00%，S3、S6次之，褐化率均为23.33%。

表5 不同培养基配方对草莓茎尖萌芽的影响Tab.5 Effects of different culture medium on shoot-tip germination of strawberry

综上所述，S7、S8和S9处理都达到了100%的萌芽率，均无污染和褐化的情况。尽管3 组处理的茎尖全部萌芽，但从组培瓶内植株的生长状况、长势大小，以及叶片颜色和数量等来看，S8处理较S7、S9处理更好，如图1 所示。因此，红颜草莓茎尖萌芽最适激素浓度配比为1.00 mg/L 6-BA、0.20 mg/L NAA，同时还可发现GA3有促进茎伸长的作用，这与于亚军等[18]的研究结果也相一致，另外，在试验中还发现了GA3有利于草莓茎尖再生成匍匐茎。

图1 红颜草莓茎尖萌发Fig.1 Shoot tip germination of 'Hongyan' strawberry

2.3 不同培养基配方对继代增殖效果的影响

红颜草莓初代萌芽培养基选定后，将草莓进行继代培养，继代增殖结果如表6 所示。在增殖培养30 d后统计数据分析发现，9 个处理中，J2、J3、J4和J8处理增殖系数偏低未达到2.00 以上，其余处理增殖系数均超过2.00。增殖系数最高的是J1处理，为3.00，在该处理下草莓苗生长较快且生长状况良好，增殖的丛芽也较多；其次为J6处理，虽丛芽生长数量不及J1处理，但其芽苗生长质量较好且增殖系数也达到了2.60；增殖效果最差的是J2处理，增殖系数仅为1.27。

表6 不同培养基配方对草莓继代增殖的影响Tab.6 Effects of different culture medium on subculture of strawberry

综上所述，红颜草莓继代增殖的最佳培养基为J1处理：MS+0.50 mg/L 6-BA+0.10 mg/L KT+30.00 g/L糖+6.80 g/L 琼脂，且pH 值调至5.8。

3 结论与讨论

在植物组织培养中，激素起到了非常重要的作用，并且不同植物或不同培养阶段所需求的激素种类和浓度也是不同的[19-20]。在草莓组织培养中，因草莓茎尖组织培养可省去愈伤组织诱导这一步骤，因而更为广泛地作为外植体进行快繁。采用红颜草莓的匍匐茎茎尖作为外植体，得出了以下结果：红颜草莓茎尖最佳的消毒方案为75%乙醇消毒30 s，然后再用0.1%升汞消毒10 min，污染率相对较低为6.67%；较适宜的初代萌芽培养基配方为1.00 mg/L 6-BA、0.20 mg/L NAA，这与李晓青等[20]的研究结果相似，萌芽率比其高近16.70%；较优选的继代增殖培养基配方为MS+0.50 mg/L 6-BA+0.10 mg/L KT，增值系数为3.0。研究结果还表明，草莓组织培养中不同的生长阶段所需的生长调节物质种类和浓度是不一样的，这与张黎凤等[15]、于超等[19]、陈英等[21]的研究结果相一致。

在消毒部分试验时，T8污染率远高于T5，究其原因可能为接种过程中操作不当导致，因此在后续试验过程需注意这一问题。除此之外，在红颜草莓增殖培养中，增殖情况与一些研究有一定的差异[22-24]。其中，薛其勤等[24]研究指出，红颜草莓增殖阶段采用0.80 mg/L 6-BA、0.50 mg/L NAA 的激素搭配方式增殖系数高于许多研究，也与本研究差异较大。导致差异较大的原因可能有培养基内接种草莓苗数量不同，激素浓度及种类选择的差异，草莓生长环境及季节不同而导致的差异，操作过程中由于操作不当使得培养基污染，同时还有部分草莓苗因褐化而没有增殖等。由此可见，不论是对于草莓组培生长发育过程来说还是对于其余各类果树花卉而言，植物生长调节物质间浓度的选择与搭配是至关重要的，同时植物激素的浓度还会因树种、品种、培养部位等的不同而有一定的差异与变化。因此，在植物组织培养中，从组培苗的各个生长阶段角度来看，对植物生长调节剂种类和浓度进行筛选依旧是今后组培工作中的重点与难点[18]。除此以外，研究仅针对红颜草莓消毒、萌芽及增殖方面进行了试验，虽对于组培工作有一定的参考意义，但对草莓苗在基础培养基选择及褐化等方面的研究还有所缺乏，所以此方面工作也可成为后续工作的一个研究方向。