TrxR1在胃癌中的表达及其对预后影响的研究①

王方园,王洋啸龙,魏晓英

(齐齐哈尔市第一医院普外二科,黑龙江 齐齐哈尔 161000)

胃癌是最常见的癌症之一。以胃腺癌(gastric adenocarcinoma GAC)为最常见的组织学类型,造成了巨大的医疗负担,是世界范围内最常见的癌症死亡原因之一。目前针对胃癌的其他分子靶向治疗方式日益丰富,但是有效率和适用范围亟待提高。临床急切需要寻找新的诊断和治疗靶点,针对靶点治疗该病[1]。越来越多的专业将研究的经历和注意力放在了肿瘤发病的分子机制上。硫氧还蛋白还原酶,简称为TrxR。它被解释为是一种NADPH依赖,同时包含FAD结构域一种酶,这种酶是二聚体硒酶,是吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶之一。细胞氧化还原调节网络的核心角色之一是TrxR/Trx系统参与的,文献报道[2],研究证实了TrxR/Trx系统参与了癌症的发生发展,并在癌症中起到了重要的作用。目前TrxR1与GAC的研究较少,尚无关于TrxR1和GAC患者预后的报道。本研究分析TrxR1在GAC中的表达情况,探讨TrxR1表达与GAC患者诊疗的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017-02～2021-08齐齐哈尔市第一医院门诊收治入院的胃腺癌患者100 例,收集的组织是胃癌组织和距肿瘤切缘约1.5cm癌旁组织标本作为研究对象,分成两个组,实验组胃癌组织50例和对照组癌旁组织50例。实验组男28例,女22例;年龄45～75岁,平均(60.54±4.12)岁。对照组男26例,女24例;年龄43～76岁,平均(59.02±3.86)岁。两组的一般资料经过数据统计,无统计学意义(P>0.05),可以用来临床研究。参与研究的患者和家属了解项目内容具有知情同意权,经齐齐哈尔市第一医院医学伦理委员会审核批准项目研究内容。

纳入标准:(1)收集到的患者病历基本资料、现病史、既往史、病理诊断、辅助检查资料齐全完整,无漏项;(2)患者确诊胃癌疾病必须符合 《胃癌规范化诊疗指南》中对胃癌的诊断标准;(3)患者意识清楚,符合手术适应证;(4)患者无其他系统疾病;(5)患者能够配合治疗,按时随访。

排除标准:(1)胃癌合并其他疾病的患者;(2)既往手术史行放疗、化疗及药物治疗;(3)不能完成随访资料提供者;(4)胃癌合并全身感染等疾病。

1.2 研究方法

(1)免疫组化实验:胃腺癌组织和癌旁组织中TrxR1的表达情况,采用免疫组化SP法完成,操作方法:将收集的胃癌组织和癌旁组织分别从1开始全部编号,甲醛固定,石蜡包埋切片,按照免疫组化SP试剂盒说明书操作,滴加生物素工作液12h后,洗片再滴加链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液孵育12h,显色用DAB染色,再用苏木素复染,酒精依次浓度脱水,二甲苯封片,完成后在显微镜下观察组织的染色情况记录数据。(2)Western blot实验:用RIPA缓冲液,提取组织总蛋白,在10%SDS-PAGE电泳后转移到PVDF严格按照试剂盒(鼠抗人TrxR1多克隆抗体检测试剂盒,美国Sigma公司)根据试剂盒内的操作说明,以酶标仪读数来判定实验的结果数据。试剂盒冷藏保存,取出试剂盒后在室温下放置15～30min左右再开始操作。每次加样时间在5min内完成,目的是为了避免误差,加样器加样校对准确性。在室温下用5%无脂牛奶阻断2h后,在4℃下用抗PLAGL2的一级抗体处理膜,在室温下与二级抗体孵育1h,并用ECL检测试剂盒检测,完成实验操作,观察成像结果。染色后的组织切片通过显微镜采集,使用软件对图片进行光密度值检测,IOD=阳性面积×平均光密度。(3)RT-PCR实验:用TRIzol试剂裂解细胞,按试剂盒说明书步骤完成实验操作,从胃癌组织和癌旁组织中分别提取RNA,再逆转录试剂盒合成cDNA。用SYBR Green (Vazyme,Nanjing, China)进行qPCR扩增。扩增条件是90℃,15min,在95℃,20秒,60℃,90秒,循环45次。TrxR1的qPCR引物:TrxR1上游引物5’-AGCTCA GTC CAC CAA TAG TGA-3’,下游引物5’-GGTATT TTT CCA GTC TTT TCA T-3'。计算目的基因的相对转录水平采用相对定量法(2-△△CT法)。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 免疫组化的表达情况

50例患者的胃腺癌组织标本中,发现TrxR1的阳性率为82.0%(41/50),癌旁组织标本中,发现TrxR1的阳性率为18.0%(9/50)。胃腺癌组织的TrxR1阳性率显著高于癌旁组织的TrxR1阳性率,有统计学意义(χ2=6.04,P<0.01)。

2.2 Western blot的表达情况

实验组的胃癌组织中检测TrxR1蛋白表达含量为(5.45±1.21),对照组癌旁组织中检测TrxR1蛋白表达含量为(2.45±1.01),实验组数值显著高于对照组数值,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 Western blot实验结果比较TrxR1在实验组和对照组的表达情况

2.3 RT-PCR的RNA 表达情况

实验组的胃癌组织中检测TrxR1 RNA表达为(3.57±1.04), 对照组癌旁组织中检测TrxR1 RNA表达为(0.85±0.31),实验组显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01),见表2。

表2 RT-PCR实验结果比较TrxR1在实验组和对照组的RNA 表达情况

3 讨论

胃癌是全世界发布率极高的恶性肿瘤,全球排在第3位,病死率排在第5位,严重影响到我国的整体生存质量[3]。胃癌的发病原因归结为其癌细胞的增殖能力十分强,且凋亡能力弱引发的,值得临床关注[4]。因此寻找抑制胃癌细胞的过度增殖,加速胃癌细胞的凋亡将成为人们研究的关注点,这对以上问题找出生物学靶点,在胃癌治疗的进展和预后有着积极的指导意义。

人体主要的抗氧化系统之一包括硫氧还蛋白,它由 NADPH 、Trx1和TrxR共同构成。硫氧还蛋白他主要是能够调节机体的氧化还原反应,还可以调节机体的免疫应答反应,另外可以调节机体的转录因子反应,调节的机体反应对人体有着重要的意义。TrxR 是二聚体黄素酶,参与人体细胞的增殖作用凋亡作用,并且起到重要的参与作用,关系密切。故此很多学者将TrxR1用于肿瘤的研究,同样发现TrxR1在肿瘤中也高表达,具有参与作用[5]。文献报道发现,TrxR1在肺癌、乳腺癌、肝癌、结肠癌、直肠癌等很多肿瘤中检测证实都出现高表达的现象,同时证实了它在肿瘤的发生、发展的整个过程中及肿瘤预后都有重要的作用[6,7]。研究[8]发现,在同一患者中检测TrxR1发现,其正常乳腺组织和其乳腺癌组织中,乳腺癌组织的TrxR1显著升高,出现高表达现象,统计学具有意义。文献报道TrxR1在肝细胞癌中高表达,下调TrxR1的水平可抑制Huh7和SK-Hep-1肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭,与肺癌患者预后不良相关。

本研究结果显示,免疫组化检测50例患者的胃腺癌组织标本中,TrxR1的阳性率为 82.0% ,癌旁组织阳性率为18.0%。胃腺癌组织的 TrxR1 阳性率显著高于癌旁组织的TrxR1阳性率,有统计学意义(P<0.01)。Western blot检测实验组TrxR1蛋白表达含量为(5.45±1.21),对照组TrxR1蛋白表达含量为(2.45±1.01),两组数据比较,有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR结果,胃癌组织中TrxR1蛋RNA表达和癌旁组织TrxR1RNA表达比较,实验组显著高于对照组(P<0.01)。与吴俊超研究结果一致[9],该检测80例胃癌患者组织标本中,有52例( 65%) TrxR1在胃癌组织中高表达,28例( 35%) TrxR1 在癌旁组织中高表达(P<0.05)。以上研究都说明了TrxR1在胃癌早期诊断方法和干预手段中起到重要的作用,如果针对TrxR1进一步研究诊疗能够提高患者的5年生存率,可以节省经济效益。

综上所述,本研究证实了在胃癌中检测TrxR1高表达,提示该因子与胃癌的诊断和不良预后呈正相关性,TrxR1可能是胃癌诊疗的靶基因,为胃癌的的治疗提供实验依据及新的思路。以胃癌生物学标记为胃癌发病机制提供新的理论依据和深层资料,同时可为胃癌的早期诊断提供诊断依据和治疗靶点,能够提高胃癌患者的早期检出率和有效治疗率,对医疗具有重大的意义。未来我们将研究的焦点集中在 TrxR1 在胃癌发生过程中的分子机制中,期待发现 TrxR1在胃癌化疗药物方面的研究意义,提高胃癌患者的生存率,提高生存质量,延长生存时间。