壮医针刺对神经病理性疼痛大鼠脊髓背角自噬蛋白表达的干预作用研究

莫巧明,廖炼炼,廖文彦,邹文静,艾文杰,梁英业,田永强

(1. 广西中医药大学附属国际壮医医院,广西 南宁 530201;2. 广西中医药大学第一附属医院,广西 南宁 530023;3. 广西中医药大学,广西 南宁 530001)

神经病理性疼痛(neuropathic pain,NPP)的发生多由于躯体感觉神经系统的损伤和疾病而直接造成[1]。它是由周围或中枢神经系统原发或继发性损害、功能障碍或短暂性紊乱(transitory perturbation)而引起的疼痛[2]。临床中常见的NPP主要有外周性和中枢性、急性和慢性、刺激诱发性和刺激自发性等3种分类方法[3]。慢性疼痛的发病,约1/5是由于NPP引起[4],神经损伤和炎症刺激导致NPP患者受到疼痛的困扰,并存在进一步损害肢体功能的可能,对患者的身心健康和经济状况造成极大的负担。目前,现代医学的常规疗法,如口服药物等[5],虽然能够对NPP具有一定的缓解作用,但长时间使用此类药物可产生多种不良反应。基于此,寻求治疗NPP的有效方法以解除患者的痛苦,减轻社会经济负担成为了医学界当前亟待解决的问题。在传统医学中,外治疗法由于其对疼痛治疗的有效性,且无毒副作用的优势,受到了越来越多的重视[6-8]。壮医针刺疗法对于疼痛的治疗效果得到了临床的证实,但目前尚缺乏对于其作用机制的相关研究[9]。相关文献指出[10],炎症因子的负面刺激与NPP的发生发展存在密切关联,而细胞自噬对促炎因子具有抑制作用,相关机制已成为NPP研究的热点。P62是细胞自噬过程中的关键蛋白[11]。因此,本研究以上述机制为切入点,运用壮医针刺对NPP大鼠模型进行干预,观察验证壮医针刺疗法对NPP的治疗作用及对自噬标志蛋白P62及炎症因子IL-6、TNF-α表达水平的影响,从而进一步探寻壮医针刺疗法治疗疼痛的内在机制。

1 材料

1.1实验动物 本实验选取50只成年雄性SD大鼠进行,采购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司,大鼠体质量在250～300 g之间,生产许可证编号:SCXK(湘)2019-0004,使用许可证编号:SYXK(桂)2019-0001。在实验开始前行7 d适应性喂养。大鼠均采取单笼喂养,实验室温度控制在20～25 ℃之间,空气湿度控制住35%～45%之间。保持环境清洁,大鼠可自由饮用自来水,以普通清洁鼠饲料饲养。

1.2主要试剂 RIPA细胞裂解液(C1053,北京普利莱基因技术有限公司);BCA蛋白定量试剂盒(BCA Protein Assay Kit)(E-BC-K318-M,Elabscience);30%丙烯酰胺(PAGE Pre-Solution,A1010,Solarbio);1 M Tris-HCL缓冲液(pH=6.8,T1020,Solarbio);1.5 M Tris-HCL缓冲液(pH=8.8,T1010,Solarbio);Marker(#26617,Thermo);PVDF膜(IPVH00010,Millipore);封闭专用脱脂奶粉(P1622,北京普利莱基因技术有限公司);牛血清白蛋白(BSA,A8020, 索莱宝);超敏发光液(RJ239676,赛默飞);内参一抗:Mouse Anti-β-Actin(HC201,TransGen Biotech,1/2000);二抗:HRP conjugated Goat Anti-Mouse IgG (H+L) (GB23301,Servicebio,1/2000);目的一抗:Rabbit Anti p62 (af5384,Affinity,1/1000);ELISA试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司,PI328,PT516)。

1.3主要仪器 单道可调移液器[0.5～10 μL,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司];单道可调移液器[20～200 μL,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司];单道可调移液器[100～1000 μL,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司];低温高速离心机(5424R,Eppendorf);电热恒温水浴锅(HH-11-2,上海助蓝仪器科技有限公司);全自动酶标仪(SuPerMax 3100,上海闪谱生物科技有限公司);紫外分光光度仪(NP80,NanoPhotometer);蛋白垂直电泳仪(DYY-6C,北京市六一仪器厂);恒温摇床(TC-100B,上海领成生物科技有限公司);全自动样品快速研磨仪(Tiss-12,上海净信实业发展有限公司);超高灵敏度化学发光成像系统[Chemi DocTM XRS+,伯乐生命医学产品(上海)有限公司];全自动化学发光图像分析系统(Tanon-5200,上海天能科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1动物分组及造模方法 将50只SD大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、非经非穴组、壮医针刺组,每组10只。参照相关文献[12]的造模方法,通过手术结扎L5脊神经制作神经病理性疼痛大鼠模型(SNL模型)。具体操作方法如下:配制10%水合氯醛溶液溶液,按照4 mL/kg体质量的标准腹腔注射麻醉大鼠,常规备皮消毒,在两侧髂后上嵴水平连线与脊柱交点左侧,沿脊柱平行方向切开约2 cm。分离皮肤、筋膜、肌肉后撑开切口露出L5椎体双侧横突,使用咬骨钳夹断椎体与横突之间的骨骼,暴露L5脊神经,以5-0规格的手术缝合线结扎,操作过程中应注意避免牵拉脊神经以防止造成额外损伤,双层结扎以避免结扎线脱落。完成结扎后逐层缝合伤口。模型组、非经非穴组、壮医针刺组均采用上述方法造模,假手术组则只将脊神经暴露几分钟,不进行结扎,余步骤同上。

1.2.2SNL模型造模成功标准 依照相关文献[12]观察大鼠造模后若出现患肢有外翻情况,且大鼠出现跛行、自发性抬足、趾间距变窄,行走时患肢不敢着地等情况,并检测大鼠热痛缩足反应潜伏期(PWTL)是否降低,以判定SNL模型是否造模成功。

1.2.3行为学检测 热痛缩足反应潜伏期(PWTL)测定[13]:在25 ℃室温环境下,调节热板痛觉测试仪温度至55 ℃,放置大鼠到测试仪封闭透明玻璃盒内,启动计时器。观察到大鼠开始快速抬足、频繁舔足时停止计时,记录时间。设定该测试仪的切断时间为30 s,以防止大鼠烫伤。连续进行3次测定,间隔时间为5 min,将3次测定时间数据的平均值作为PWTL最终的数值。

1.2.4干预措施 术后第1天开始对非经非穴组和壮医针刺组进行干预。壮医针刺组:采用0.16 mm×13 mm针灸针,针刺模拟手背一环10穴(取大鼠前肢第五掌骨桡侧距掌指关节3 mm处)、内上桩、内中桩、內下桩、足背一环7穴(取大鼠在足背把足背横纹中点至第二、第三足趾跖蹼缘上方纹头之间分4等份,以足背中间点为中心,以1等份为半径沿足背形状作一圆环。在足背圆环上按时钟的1～12时刻分成12等份,每时刻处为1个穴位,共12个穴位。在7时刻处为足背一环7穴),针刺深度3 mm,斜刺进针,留针30 min。连续干预10 d,至第14天结束。非经非穴组:建模成功后每天针刺距离相应穴位3 mm处假穴位点,留针30 min。连续干预14 d,至第14天结束。其余组别不做干预,仅观察至第14天。

1.2.5检测标本取材 完成干预后,在实验第14天完成行为学检测后,将大鼠注射水合氯醛麻醉后采集静脉血,无痛处死后取出L4-6脊髓背角组织,放入液氮冷却,放入-80 ℃冰箱保存。

1.2.6Western Blot检测 运用Western Blot(免疫印迹法)检测大鼠脊髓背角蛋白表达水平。取出大鼠脊髓组织后,以裂解液裂解细胞,研磨匀浆放入离心机提取总蛋白。转膜后以免疫反应发光处理,放入凝胶成像仪进行分析,分别测出P62蛋白及内参蛋白条带灰度值,得到P62蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值的比值即为P62的相对表达水平。

1.2.7ELISA 检测 抽取大鼠静脉血后放入试管,将试管放入离心机离心提取血清,按照ELISA检测试剂盒步骤说明检测大鼠血清中IL-6、TNF-α的含量水平。

2 结果

2.1PWTL检测结果 造模前各组大鼠PWTL检测数值差异无统计学意义;术后第1天模型组、非经非穴组、壮医针刺组PWTL检测数值明显低于正常组、假手术组(P<0.01),模型组、非经非穴组、壮医针刺组之间PWTL检测数值差异无统计学意义;术后第14天壮医针刺组PWTL检测数值高于模型组和非经非穴组(P<0.01)。见表1、图1。

表1 各组大鼠PWTL比较 单位:s

图1 各组大鼠术前(0 d)、术后第1天、第14天PWTL比较

2.2大鼠脊髓背角P62含量的变化 术后第14天,与正常组、假手术组比较,模型组大鼠脊髓背角P62蛋白表达水平升高(P<0.01),与模型组、非经非穴组比较,壮医针刺组大鼠脊髓背角P62蛋白表达水平下调(P<0.05)。见图2。

注:与正常组、假手术组比较,*P<0.01;与模型组、非经非穴组比较,#P<0.05。

2.3大鼠血清IL-6、TNF-α含量的变化 造模后第14天,正常组大鼠血清IL-6、TNF-α含量处于低水平,与正常组、假手术组相比较,模型组血清IL-6、TNF-α含量升高(P<0.01),与模型组、非经非穴组相比较,壮医针刺组可下调大鼠血清IL-6、TNF-α含量(P<0.05)。见图3、图4。

注:与正常组、假手术组比较,*P<0.05;与模型组、非经非穴组比较,#P<0.05。

图4 各组大鼠血清TNF-α含量变化

3 讨论

壮医认为“疾患并非无中生,乃系气血不均衡”,指出了疼痛治疗的关键在于“通”,“通则不痛”,及时调畅龙路和火路,使局部得到气血滋养是治疗疼痛的指导思想[14]。“三道两路”是壮医学理论中所描述的人体基本生理系统,其中两路之中的龙路为人体血液循环系统,火路的作用则与现代医学中人体神经系统相类似[15]。两路与疼痛密切相关,两路不通或不荣皆可造成疼痛,具体包含虚实两个方面的病机,涵盖了气血循环不畅、神经通路受阻、病理性因子壅塞、气虚流动及相关神经递质、调节因子异常等情况。疼痛发生时,人体常出现“不通”的病理状态,而气血运行受阻又会导致病变部位出现“不荣”。气与血相互配合,运行流畅是维持人体正常生理状态的重要基础。当毒邪外侵机体,阻滞两路,使机体气血运行不畅,气血失衡,瘀血阻滞龙路、火路,或毒邪未尽,毒瘀互结,阻滞龙路、火路,致使两路道路不通,而发为NPP。NPP属龙路病、火路病范畴。大多数患者常常出现明显的持续性烧灼痛、闪电样或撕裂样疼痛,发作时患者常觉寝食不安,龙、火二路发生疼痛时持续数日或数月不等,部分可缠绵数年[16]。该病对患者的身心健康和生活质量具有严重的负面影响。

本研究通过运用壮医针刺疗法刺激手背一环10穴、内上桩、内中桩、內下桩、足背环一7穴对疼痛模型大鼠进行干预[17]。壮医针刺疗法在临床上大量运用环穴,其理论来源[17]为壮医针刺选穴的重要理论依据和指导原则“天圆地方”。以方圆对应天地,运用取象比类的思维,将“动”与“衡”的特点体现在配穴处方中,通过动态调整气血以恢复人体的平衡。手背一环10穴,为天部穴位,在壮医看来,手部在人体各部位中运动频率最高,联系现代解剖学知识,手部所对应的大脑皮层面积最大,手部神经末梢对针刺刺激的敏感程度也非常高,故通过刺激手背环穴可迅速将刺激信号传入“巧坞”(大脑),从而形成良性反馈,通利三道两路以缓解疼痛。与手背环穴为天部在上相对应,内上桩、内中桩、内下桩三穴为地部穴,又称为“地内三桩”,天地相对共同调节整体气血的流动。足背一环7穴为位于足背部,属于足背环穴之一,临床上可治疗腰腿疼痛等位于人体下部的疼痛,且足背部神经末梢亦较为敏感。故本研究所取穴位能够通过整体调节气血达到治疗疼痛的效果。

炎症是人体常见的一种病理状态,在多种疾病中均可出现。炎症对人体的损害是多方面的,可影响多个系统的生理功能,其负面刺激性作用是导致疼痛发生的重要因素,是NPP发生发展的重要机制[18]。炎症因子对神经系统除具有免疫相关作用外,其对神经细胞的刺激是造成疼痛的重要原因[19]。炎症表达和神经损伤是NPP的主要病理基础,神经损伤状态下,IL-6、TNF-α等炎症因子从脊髓背角和背根神经节中诱导释放,引起炎症发生,并通过级联放大作用降低神经元兴奋阈值,使外周和中枢的神经感受器致敏,提高痛觉敏感性[20]。细胞自噬是一种细胞自我保护性机制,在NPP发生发展过程中,自噬机制也参与到其中[21]。其对于相关促炎性因子具有清除作用[21],通过自噬小体的吞噬作用,可清除对神经细胞具有负面刺激作用的促炎分子,解除负面刺激作用,从而抑制炎症表达并缓解由此带来的疼痛[22],对细胞也具有保护作用[23]。相关研究表明,NPP发生时常出现自噬调节失衡。在病理性因素的刺激下,人体启动细胞自噬,清除受损细胞器,识别炎症信号,清除有害炎症因子以调控炎症表达水平,抑制炎症刺激以缓解疼痛。相关实验研究也证实了自噬抑制了SNL大鼠脊髓背角神经元的凋亡[24]。自噬机制调节炎症表达对缓解疼痛起到重要的调节作用,对IL-6、TNF-α等炎症因子的表达具有抑制作用[25]。

P62是一种重要的自噬标志性蛋白,是自噬机制中的特异性底物。在自噬过程中,P62首先结合细胞内泛素化蛋白质,然后结合LC3Ⅱ蛋白,成为自噬关节复合物,自噬机制活跃则细胞内P62蛋白会减少。反之,若自噬机制受到抑制,则P62蛋白在细胞内会增多。P62的表达水平可反映细胞自噬机制的活跃程度,在本研究中,造模后第1天,模型组大鼠热痛缩足反应潜伏期(PWTL)较正常组降低,造模后第14天,壮医针刺组大鼠热痛缩足反应潜伏期(PWTL)较模型组升高,表明实验造模成功,壮医针刺对SNL模型大鼠的疼痛具有改善作用。造模后第14天,模型组大鼠血清IL-6、TNF-α含量较正常组升高,壮医针刺组血清IL-6、TNF-α较模型组降低,表明造模导致大鼠神经损伤,炎症因子释放增减,激活炎症反应导致疼痛,经壮医针刺干预后炎症因子含量减少,减轻了神经所受到的炎症刺激,使疼痛得以缓解。造模后第14天,模型组大鼠脊髓背角组织P62蛋白表达较正常组增多,壮医针刺组大鼠脊髓背角P62蛋白表达较模型组减少,表明SNL模型大鼠细胞内自噬机制被抑制,而壮医针刺干预可增加细胞内自噬活跃水平,壮医针刺可能通过调节细胞自噬以达到缓解疼痛的效果。

综上可以推断,经壮医针刺干预后SNL大鼠脊髓背角组织P62蛋白表达水平升高,反映出细胞自噬机制被激活,从而减少了炎症因子IL-6、TNF-α的表达,减轻了神经炎症反应,达到镇痛的效果。