结核分枝杆菌DNA及RNA检测在结核病中的诊断价值*

陈江燕,王 霖,马志强,王晓燕,毛红艳,李琼秀

(昆明市第三人民医院/云南省传染性疾病临床医学中心 检验科,云南 昆明 650301)

结核病是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculoss,MTB)感染引起的慢性传染病[1],在全球22个结核病流行严重的国家中,我国疫情不容乐观,其发病人数约为每年130万左右,占全球发病率的14.3%,位居第2位[2,3]。目前检测结核菌的金标准是传统的罗氏培养,但其培养周期长、操作复杂,且存在不同程度地准确性较低、灵敏度差、周期长、特异性不高等问题[4,5]。因此需要一种简便快捷且灵敏度高、特异性强且能在临床中广泛普及的检测技术为辅助临床上结核病的早期诊断,对结核病患者的治疗预防具有重要意义[6]。本研究回顾性分析了昆明市第三人民医院诊治的1168例结核病患者实验室资料,通过采用DNA和RNA实时荧光核酸恒温扩增检测技术,探讨结核菌DNA和RNA检测在结核病中的诊断价值,现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2020年1月-2021年6月于本院接收治疗的结核病确诊病例1168例,其中男性591例,女性577例;年龄7～88岁,中位年龄44(29,57)岁。纳入标准:(1)确诊按照《肺结核诊断标准》(WS288-2017)[7];(2)经结核菌痰涂片及痰培养检查确诊为结核病。排除标准:(1)非结核菌病;(2)其它感染性及自身免疫性疾病;(3)合并重要器官疾病及严重高血压患者等。

1.2 仪器与试剂 主要仪器

结核杆菌DNA和RNA检测仪:天隆TL-988型;试剂:DNA检测试剂:结核菌复合群核酸检测试剂盒荧光PCR法,RNA检测的试剂:TB-SAT结核菌检测试剂盒RNA恒温扩增。

1.3 检测方法

实验室检测:将采集的患者标本置于无菌容器内密封送检,按照实验室操作步骤进行液化、核酸提取、PCR扩增等反应程序完成。结果判读标准:MTB-DNA阳性判断:FAM通道检测Ct值≤38.0为阳性,否则为阴性;MTB-RNA阳性判断:Ct值≤35为阳性,35

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 结核菌DNA及RNA检测情况

表1 结核菌DNA及RNA检测情况[n(%)]

2.2 不同类型标本DNA和RNA检测情况

不同类型标本中痰液DNA和RNA及DNA+RNA检测阳性最高,分别为335、170、142例,阳性率分别为55.74%、57.24%、60.43%;脑脊液DNA和RNA及DNA+RNA检测阳性最低,分别为1、0、0例,阳性率分别为0.17%、0%、0%;见表2、图1。

表2 不同类型标本DNA和RNA检测阳性情况[n(%)]

图1 不同类型标本MTB-DNA和MTB-RNA检测阳性情况

2.3 不同年龄标本DNA 和RNA检测情况

不同年龄组中,21～30岁组DNA检测阳性最高,为133例,阳性率22.13%;41～50岁组RNA及DNA+RNA检测阳性最高,分别为67、62例,阳性率分别为22.56%、25.96%;10≤岁组DNA和RNA及DNA+RNA检测阳性最低,分别为4、2、2例,阳性率分别为0.67%、0.66%、0.85%,见表3。

表3 不同年龄标本DNA和RNA检测阳性情况[n(%)]

图2 不同年龄标本MTB-DNA和MTB-RNA检测阳性情况

3 讨论

目前诊断结核病的方法有影像学检查、细菌学、免疫学检测等,结核病确诊的金标准是痰液中检出结核菌。结核病发病率较高,但其发现率却仅有40%左右,对于结核患者的快速诊断是结核防控的重要措施,而常规检测很难达到快速诊断的效果[8]。近年来,荧光定量PCR技术因其快速、高效的诊断被逐渐应用到结核的检测中,其可间接检出痰液标本中结核菌含量,也能鉴别结核菌和非结核菌,因此得到了大量普及。同时恒温扩增(SAT)技术检测不仅检测标本中结核菌存在情况,还能鉴定结核菌活性,因此可用于活动性肺结核的检测及诊断[9,10]。

本研究通过对1168例研究对象标本进行实验室检测,结果发现结核菌DNA检测阳性率远高于RNA检测,可能是因为DNA双链较RNA单链稳定,不易被降解,同时在RNA恒温扩增中RNA逆转录成cDNA,通过多聚酶等作用又形成新的RNA,虽然两种检测的状态同样一直持续进行,但RNA存在于活的结核菌中,这也可能是其阳性率低于DNA检测的原因[11,12]。在不同类型的标本中,痰液检出率较最高,这也与以往的研究结果相一致[6]。本研究结果还显示,结核菌DNA检测阳性率女性高于男性,可能的原因有结核病发病率的差异在不同性别中可能与传播动力学的因素有关,且细胞免疫、糖皮质激素、社会经济因素和文化因素等方面的差异可能都与其有一定的相关性[13]。在不同年龄段中中青年组DNA和RNA阳性检出比例最高、最常见,这可能与青年的免疫功能状态有关,也可能与青年发病时易出现菌血症或血行播散性结核病有关。

综上所述,结核菌DNA和RNA检测在结核病患者的不同类型标本和各年龄段的检出率均有差异,对患者结核菌检测方法及标本的选择有参考价值,减少误诊和漏检,可推广应用于结核病的实验室诊断工作中。