不同海拔黄果柑果实有机酸代谢的生态响应

吴 娇,龚成宇,陈超群,陈红旭,刘俊宏,唐文静,初元琦,杨文龙,张 瑶,龚荣高

(四川农业大学 园艺学院,四川 成都 611130)

黄果柑(Citruscultivarcv. Huangguogan)属芸香科(Rutaceae)柑橘属(Citrus),具无核、优质、晚熟等特点,是我国大渡河流域中段干暖河谷区特有的天然杂交柑资源[1]。汉源地区,黄果柑适宜栽培的海拔范围为800～1 200 m,不同海拔因温度、湿度和光照等生态因子的差异大幅度地影响着果实的品质及生长代谢[2]。柑橘果实中含丰富内含物,糖分、有机酸含量及二者比值是决定果实风味的重要指标[3]。果实内有机酸含量比糖含量的变化幅度大,因此有机酸对决定糖酸比大小而言更为重要[4]。已有柑橘有机酸代谢方面研究表明,柠檬酸合成酶(CS)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、苹果酸脱氢酶(MDH)、顺-乌头酸酶(ACO)和异柠檬酸脱氢酶(NADP-IDH)是柠檬酸代谢的关键酶[5],上述酶通过三羧酸循环共同参与柠檬酸代谢;在不同砧木与黄果柑果实有机酸含量的影响研究中,NADP-IDH被认为是关键限制因子[6]。目前黄果柑产地因海拔不同造成果实品质差异明显,一定程度上制约了黄果柑产业的均衡发展。本试验主要通过测定不同海拔间黄果柑果实中有机酸含量、柠檬酸代谢相关酶活性及基因表达量之间的关联性,掌握海拔对黄果柑有机酸代谢的影响,为因地制宜栽培黄果柑,提高果实品质,提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地点

试验地位于四川省雅安市汉源县小堡藏族彝族乡(102°33′E,29°18′N),地处大渡河中游南岸,山地地形,海拔840～1 200 m,年均气温16.5 ℃,无霜期300 d左右,日照时数达1 475.8 h,年活动积温>5 500 ℃,年均降水量650 mm,土壤类型为红壤土。

1.2 试验材料

本次试验在同一山体海拔高度分别为875 m、1 014 m和1 174 m处选取3个黄果柑种植样点作为本试验的3个处理(3个点的环境情况如表1所示),各海拔3个小区,每小区3株,共27株7年生黄果柑,砧木枳壳,株行距2.5 m × 4 m,所有黄果柑的栽植均为东西行向,树势、树距、管理方式等一致。试验材料从2018年4月开始统一管理,观察记录各样点开花时期,于花后75 d开始,每隔15 d进行一次样品采集(每株树树冠外围中上部的东、南、西、北四个方向各3个),直至果实成熟,将采集的果实液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存备用。

表1 不同海拔高度黄果柑园区的主要气候因子差异Table 1 The difference of main climatic factors in Huangguogan gardens at different altitudes

1.3 黄果柑果实有机酸组分含量测定方法

参照肖玉明[7]的高效液相色谱(HPLC)法,检测条件略作修改。流动相[甲醇∶磷酸二氢钾(0.06 mol·L-1,pH值2.5)=4∶96(V/V)],上机前抽滤(有机相,0.22 μm)超声(25 ℃、20 min);进样量为10 μL。

1.4 黄果柑果实柠檬酸代谢相关酶活性测定方法

柠檬酸代谢相关酶液制备和酶活性测定参照龚荣高[8]的方法。

1.5 总RNA提取及cDNA合成

果实RNA提取按照TreliefTMRNAprep Pure Plant Plus Kit (Polysaccharides &Polyphenolics-rich) RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒进行。提取的RNA用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分别进行质量检测和浓度分析,然后再按照GoldenstarM RT6 cDNA Synthesis Kit Ver. 2反转录试剂盒进行反转录,合成试验所需cDNA。

1.6 果实有机酸代谢相关酶基因qPCR分析

参考曹淑燕[9]的黄果柑相关基因序列片段,运用Primer 6.0软件进行引物设计,设计序列见表2,使用2×TsingKEMaster qPCR Mix (SYBR Green I)荧光定量试剂盒进行qPCR验证。

表2 黄果柑果实有机酸代谢相关酶基因qPCR序列Table 2 qPCR sequence of organic acid metabolism-related enzymes in Huangguogan fruit

1.7 数据分析

试验数据通过Microsoft Excel和SPSS 20.0软件整理并分析,采用Origin85软件绘图。

2 结果与分析

2.1 海拔对黄果柑果实发育过程中酸含量的影响

由图1知,各海拔黄果柑果实苹果酸和奎宁酸含量花后75～330 d呈下降趋势,在果实发育后期趋于平稳,且含量占比较低;柠檬酸含量与有机酸含量变化趋势一致,在果实发育前期增加中后期降低,含量占比高达48.48%～96.85%,说明黄果柑果实有机酸的积累以柠檬酸为主。在果实发育前期(柠檬酸大量合成时期),随着海拔升高,柠檬酸含量越高,而成熟期柠檬酸含量与海拔高度呈反比,说明柠檬酸含量在后期降解是影响果实有机酸含量的主要原因,海拔越高,柠檬酸降解程度越大。

2.2 海拔对柠檬酸合成酶类活性的影响

由图2知,CS活性自花后135 d活性差异较小。与之类似,不同海拔间MDH的活性差异不大。说明CS、MDH活性与柠檬酸含量及海拔的关联性不大,不同海拔间果实柠檬酸含量最终差异并非由CS和MDH活性差异造成。PEPC活性和柠檬酸含量在果实发育中后期都呈下降趋势,且在成熟期都表现为海拔越高,活性和含量越低。由此可以得出,在试验海拔范围内,海拔越高,PEPC活性越低,柠檬酸合成量越少。

图2 不同海拔黄果柑果实成熟期有机酸合成酶类活性的变化Fig.2 Changes of organic acid synthase activity in Huangguogan fruit at different altitudes at mature stage

2.3 海拔对柠檬酸分解酶类活性的影响

由图3知,各海拔间细胞质ACO和NADP-IDH活性分别自花后105 d和195 d开始表现出与果实柠檬酸降解程度相一致的规律,即海拔1 174 m>1 014 m>875 m,NADP-IDH活性随着果实成熟逐渐升高,特别是在255 d后剧烈增加,细胞质ACO活性全程保持在较高水平。线粒体ACO活性在不同海拔间没有表现出明显规律,且自花后135 d开始其活性稳定在较低水平。由此说明,NADP-IDH作用关键时期是在果实成熟后期,一定范围内海拔升高显著提升了柠檬酸降解阶段果实细胞质ACO活性和成熟期NADP-IDH活性,从而促进了柠檬酸降解,造成黄果柑果实柠檬酸含量随海拔升高而降低。

图3 不同海拔黄果柑果实成熟期有机酸分解酶类活性的变化Fig.3 Changes of organic acid synthase activity in Huangguogan fruit at different altitudes at mature stage

2.4 海拔对柠檬酸合成酶类基因表达的影响

由图4知,MDH基因表达量呈下降-上升-下降的趋势,与其酶活性变化趋势有较大差异,CS和PEPC基因表达量与二者酶活性的变化趋势虽大体一致,但CS自花后135 d开始,其基因表达丰度差异在不同海拔间的规律较为紊乱,PEPC基因在各海拔间的相对表达丰度差异也不大,表明海拔与柠檬酸合成酶类的基因表达没有明显关系。

图4 不同海拔黄果柑果实成熟期有机酸合成酶类基因相对表达丰度的变化Fig.4 Changes of relative expression level of organic acid synthetic enzyme genes in Huangguogan fruit at different altitudes at mature stage

2.5 海拔对柠檬酸分解酶类基因表达的影响

图5显示,各海拔间ACO和NADP-IDH基因相对表达丰度自花后165 d开始表现为海拔1 174 m>1 014 m>875 m,由高到低各海拔果实ACO基因相对表达量的峰值在果实发育前期出现在花后135 d,后期则分别出现在花后240 d、300 d和330 d,NADP-IDH的基因相对表达丰度和酶活性自花后195 d开始,都表现出随海拔升高而上升的趋势。由此判断,海拔的升高可能会通过提前启动ACO基因表达和增加NADP-IDH基因表达量来提升细胞质ACO及NADP-IDH活性,以促进果实柠檬酸的降解。

图5 不同海拔黄果柑果实成熟期有机酸分解酶类基因相对表达丰度的变化Fig.5 Changes of relative expression level of organic acid synthetic enzyme gengs in Huangguogan fruit at different altitudes at mature stage

3 讨论

黄果柑果实有机酸中柠檬酸占比最大,且在果实酸降解过程中降解最多,这与代琳等[10]研究一致,其在不同海拔之间的不同降解程度是导致黄果柑果实有机酸含量最终差异的决定性因素。

在本研究的海拔区段内,海拔主要通过影响柠檬酸降解程度来影响有机酸含量,海拔越高果实发育后期柠檬酸降解程度越大,这与曹永华等[11]和孙国超等[12]研究结果相近。毛如志等[13]研究也表明,美乐葡萄果实酸含量变化受到海拔区段影响。与之相反,罗显扬等[14]对朋娜脐橙研究认为果实有机酸的含量与海拔呈正相关,这可能是与不同果实种类有关。

海拔主要是通过对光、热、水、气、土壤和生物等生态因子的影响而对果实品质起间接的生态作用。光照是黄果柑光合作用的能量来源,有研究表明,在秋季阴雨低温天气中,随着日照时数的增加,尾张温州蜜柑酸度相应增加[1],此外,在马瑟兰葡萄的研究中也有数据指出,葡萄果穗遮光后其可滴定酸含量增加,完全遮光后,可滴定酸含量显著增加[2]。温度主要通过影响光合作用的效率而影响果实碳水化合物的积累,我国甜橙在日均气温≥10 ℃的活动积温低于8 000 ℃时,随年积温的增加,可滴定酸含量逐渐降低[3],大多数柑橘品种在炎热潮湿的热带地区含酸量低于亚热带地区[4]。降雨量和空气湿度也会在不同程度上影响果实的可滴定酸含量,有报道指出,生长期降雨量与苹果果实中的有机酸含量呈显著正相关[5],空气相对湿度越低,柑橘果实的酸含量也越低[6]。在本研究中,黄果柑园区中主要气候因子在不同海拔间均表现出了一定的差异,随着海拔的升高,光照强度、年平均空气相对湿度和年平均日温差表现出了增大的趋势,海拔1 174 m处的光照强度、年平均空气相对湿度和年平均日温差较海拔875 m处分别增加约8.2%、6.2%和59.7%,而年平均气温和≥10 ℃年积温这两个指标则随着海拔的升高而降低,海拔1 174 m处的年平均气温和≥10 ℃年积温较海拔875 m处分别降低约13.7%和6.2%。由此说明,不同海拔间的主要气候因子差异较大,但哪个气候因子是造成不同海拔间黄果柑糖品质差异的关键还需要进一步分析。

不同海拔果实柠檬酸代谢相关酶活性测试结果表明,各海拔间CS活性仅在花后75～105 d表现出显著差异,之后没有表现出较强活性差异规律,这可能是造成果实有机酸积累阶段在不同海拔间出现差异的原因。PEPC和MDH活性整体表现出下降趋势,这可能是造成柠檬酸含量在花后120 d开始降低的重要原因。MDH在整个发育期没有表现出较强活性差异规律,果实发育中后期PEPC活性与柠檬酸含量在不同海拔间表现出一致规律,说明不同海拔间PEPC活性差异对柠檬酸含量具有一定影响。细胞质ACO活性在果实成熟期活性较高,NADP-IDH活性随着果实成熟逐渐升高,且表现为海拔越高,果实柠檬酸降解程度越高,说明成熟期细胞质ACO活性的增加有利于降低果实柠檬酸水平[21],NADP-IDH是果实发育后期柠檬酸降解的关键酶,这与龚荣高[8]在不同生境下脐橙果实酸代谢中所找到的主要酶一致。总的来说,一定范围内海拔升高显著提升了果实柠檬酸降解阶段细胞质ACO活性和NADP-IDH活性,从而促进了柠檬酸降解,造成黄果柑果实柠檬酸含量随海拔升高而降低。

各酶基因表达丰度的结果表明,由高到低各海拔果实ACO基因相对表达量峰值出现的时间有所提前,说明海拔升高可能是通过提前启动ACO基因的表达来提升细胞质ACO的活性。NADP-IDH基因表达量随海拔上升的趋势也说明,海拔升高有利于提升果实NADP-IDH基因的相对表达丰度,从而调控其酶活性,促进果实柠檬酸的降解,造成不同海拔间果实有机酸的含量差异,这与曹淑燕等[6]在不同砧木黄果柑果实酸代谢的研究中所找到的差异关键基因具有一致性。本研究中PEPC活性在不同海拔间差异显著,但PEPC基因的表达在不同海拔间却没有显著差异,产生这一现象的具体原因还有待进一步研究。

4 结论

黄果柑果实有机酸的积累以柠檬酸为主,不同海拔间果实有机酸含量差异是由柠檬酸降解程度不同所引起的,一定范围内随海拔升高果实柠檬酸含量反而下降。海拔的改变带来的光照、温度和湿度等气象因子的改变可能是造成酸积累差异的重要因素。NADP-IDH、细胞质ACO和PEPC是造成不同海拔间有机酸积累差异的主要酶。海拔的升高可能会通过提前启动ACO基因表达和增加NADP-IDH基因表达量来增加细胞质ACO及NADP-IDH活性,促进果实柠檬酸的降解,导致果实有机酸含量降低。因此,在生产中进行栽培时,应注意海拔对黄果柑果实酸积累的影响。结合本文的研究结果而言,在四川地区种植黄果柑应选择高海拔内较为适宜,此时果实有机酸含量最低。