香稻苟当3号香味成分与土壤养分相关性分析

王学良, 王忠妮, 李祖军, 徐海峰, 龚记熠, 浦选昌, 郑桂云, 张玉珊, 朱速松

(1.贵州师范大学生命科学学院,贵州贵阳 550001; 2.贵州省农业科学院水稻研究所,贵州贵阳 550006;3.贵州省黔东南州农业科学院,贵州黔东南 556099; 4.贵州省农业科学院生物技术研究所,贵州贵阳 550006)

我国香稻因具有浓郁的香气,广受消费者的喜爱。人们目前普遍认为,香稻中主要香味物质为 2-乙酰-1-吡咯啉2-AP,2-AP的合成主要是因为Badh2基因突变所导致的[1]。Badh2基因会编码甜菜碱醛脱氢酶,催化4-氨基丁醛转化为4-氨基丁酸,由此使得2-AP的合成遭到抑制,导致稻米缺乏香气。当Badh2基因突变后,甜菜碱醛脱氢酶失去活性,抑制了4-氨基丁醛向4-氨基丁酸的转化,解除了对2-AP合成的抑制,从而使稻米产生了香味[2]。研究发现Badh2的突变类型复杂多样,在1、2、4、5、7、10、12、13、14外显子上都有突变位点[3]。最常见的为Badh2.1,即第7外显子上所发生的8碱基缺失以及3碱基突变,著名香稻Basmati和Jasmine便是这种等位基因型[4]。然而影响稻米香味的物质并不只有2-AP,除2-AP外稻米中100多种物质可产生香味,主要包括醛、酮、醇、烃类等[5]。醛类物质在稻米挥发性物质中占重要地位,其中壬醛、己醛、庚醛、辛醛对稻米香味影响最大[6]。研究发现,香稻的生长条件也会影响自身的香气浓度,如光照、温度、水分、肥料、矿质元素、盐分等因素[7]。徐振江等发现,温度对稻米香味浓淡有着重要影响,当稻米的生长温度大于25 ℃时稻米的香味就会有所下降[8]。Bao等的研究表明,利用干湿交替的方式进行灌溉最终会使稻米有更加浓郁的香气[9]。钟群等研究发现,氮肥可以增加稻米中游离脯氨酸,并且可以促进2-AP的积累[10]。孙树侠等研究发现,在氮元素含量较高的种植地稻米中2-AP含量会更高,香味更浓[11]。Mo等研究发现,施硅肥也可以增加稻米中2-AP的含量[12]。Luo等研究发现,硒肥也可以使稻米中2-AP的含量增加[13]。唐湘如等研究发现,在水稻生长期间,喷洒氯化镧能显著提高稻米中2-AP的含量,使稻米香味更浓[14]。

苟当3号是贵州省黔东南州精心培育的特有香稻品种,它香气怡人,品质优良。生产中发现,不同地区种植的苟当3号其稻米香味浓度具有较大差异。为明确苟当3号产生香味以及不同种植点香味浓度差异的原因,本研究分析了苟当3号中Badh2的基因型,并对不同种植点的稻米进行了香味鉴定、挥发性成分分析,以及土壤成分分析,以期揭示不同地区种植的苟当3号香味差异形成的原因。

1 材料与方法

1.1 试验材料及样品处理

苟当3号于2021年种植于贵州省从江县5个不同地区,种植点从高到低依次为高岭857 m、机英林637 m、芩木535 m、高大437 m、虾板242 m。材料进行正常田间管理,抽穗后取叶片置于超低温冰箱中保存,种子成熟后室温放置3个月,性状稳定后称取饱满的稻谷20 g,用绿洲锋速LTJM160型精米机脱壳,用FS-Ⅱ型实验室旋风式粉碎磨磨成米粉过50目筛,真空包装,-20 ℃保存。

1.2 香味感官评价试验

将5 g叶片打碎倒入试管后加1.7%氢氧化钾溶液,用橡胶塞堵住管口,常温浸泡10 min后打开试管逐一嗅其气味,并对香味浓度进行评定。根据Golam等的方法[15]对水稻的香气进行评分。对样品按5个标准进行评分,其中1、2、3、4、5分别对应无香气、轻度香气、中度香气、高度香气、特浓香气。所有的样本都由3名经验丰富的小组成员进行评分。

1.3 苟当3号Badh2基因全长测序

为验证苟当3号会产生香气的原因是否为Badh2基因的突变而导致的,对苟当3号的Badh2基因全长进行测序。首先待抽穗后从大田内收取材料的叶片组织采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取材料叶片组织DNA。其次在NCBI网站上搜索Badh2基因的全基因组序列,引物参考Shi等在文献中设计的10对Badh2基因全长扩增引物[2]。由北京擎科生物科技有限公司合成这10对引物。合成后对苟当3号的DNA进行扩增。其扩增产物经1%琼脂糖凝胶电咏检测合格后送北京擎科生物科技有限公司进行测序,并使用DNAman对测序结果进行对比分析。

1.4 挥发性成分分析

将25 g米粉倒进50 mL顶空进样瓶中,盖好瓶口,加入40 mL ddH2O后放置于加热平台。于80 ℃进行加热,一定温度平衡20 min。平衡后将萃取头刺穿隔垫,调整高度置于样品上方5 cm处,萃取吸附40 min后将纤维头插入气相色谱-质谱仪进口解吸5 min。进样口温度255 ℃,流速1.0 mL/min。起始柱温为45 ℃,以9 ℃/min的速度升温,温度达到255 ℃后保持10 min。电离方式EI,质谱扫描范围40～500 amu/s,检索数据库NIST11。

1.5 土壤检测方法

pH值采用pH计进行检测;有机质含量采用重铬酸钾滴定比色法测定;全氮含量采用凯氏定氮法测定;全钾含量采用NaOH熔融火焰光度法测定;碱解氮含量采用碱解扩散法测定;速效磷含量采用钼锑抗比色法测定;速效钾含量采用NH4AC浸提法测定;全磷含量采用碱溶钼锑抗比色法测定。

1.6 数据分析

使用Thermo TraceFinder 4.1软件对数据进行处理,未知成分经过检索后同标准数据库进行对比。筛选出综合分大于70同时正反比对分数大于600的物质。将筛选出来的物质的保留指数与NIST library(2017)数据库进行比对来确定其成分。挥发性物质的相对含量应用面积归一法计算。数据处理采用Excel 2021。

2 结果与分析

2.1 香味感官评价试验

本研究在从江县选取5个地区对苟当3号进行种植。采用KOH浸泡法对5个地区的稻米香味给予评判。由10人组成小组每人2次对材料进行闻香味试验并对香味浓度进行打分。通过感官试验,发现不同种植点种植的稻米的香味存在差异(表1)。在高岭种植点稻米的香味最为浓郁,在虾板种植点香味得分最低。

表1 稻米香味感官评价排列

2.2 苟当3号Badh2基因全长测序结果

为探究苟当3号产生香味是否为Badh2基因突变所致,对苟当3号中Badh2基因进行测序。序列对比结果显示,苟当3号的Badh2基因在第7外显子表现为3 bp突变以及8 bp缺失(图1),从而断定苟当3号会产生香气是由于Badh2基因的突变所致。

2.3 5个不同种植点稻米挥发性成分分析

为了探究苟当3号在不同种植点香味差异的原因是否与2-AP含量有关,本试验对不同种植点苟当3号中香味挥发物2-AP浓度进行测定。从检测结果来看不同种植点苟当3号中2-AP的浓度存在差异(表2)。且随着种植点海拔的升高稻米中2-AP的含量也随之增加(图2)。同时为研究其他挥发性物质对苟当3号香味的影响,本研究对5个种植点稻米中的挥发性成分进行分析,检测出的挥发性成分主要包括醛类(壬醛、己醛、庚醛、辛醛、戊醛、苯甲醛等)、醇类(1-锌烯醛-3-醇、正己醇等)、酮类(3-己酮、2,3-丁二酮等)(表3)。通过检测结果发现不同种植点其稻米中的挥发性物质存在较大差异。在高岭种植点稻米香味最为浓郁,而虾板种植点香味最低,在高岭种植点稻米中2-AP与壬醛的含量都高于虾板种植点,且这2种物质的浓度都随着种植点的升高而增加。2-AP与挥发性物质相关性分析结果(表4)表明,2-AP与壬醛呈极显著正相关,与异丁醛则不相关。造成二者间香味浓度差距的主要原因可能是由于稻米中2-AP与壬醛含量的差异。

表2 不同种植点稻米2-AP浓度

表3 苟当3号材料不同海拔高度种植地点各类挥发物质种类及其含量的GC-MS分析结果

表4 2-AP与挥发性物质的相关性分析结果

2.4 不同种植点的土壤特性

为明确苟当3号的香气浓度与土壤成分的关系,本研究对5个种植点土壤的碱解氮含量、速效钾含量、有效磷含量、全磷含量、全钾含量、全氮含量、有机质含量及pH值共8个指标进行测定。检测结果(表5)显示以上8个指标在从江县5个种植点中分布具有较大差异,碱解氮含量在机英林种植点最高,为287.67 mg/kg;有机质含量在高岭种植点最高,为52.43 g/kg;pH值在高岭种植点最高,为5.37;全钾、速效钾含量在芩木种植点最高,分别为14.36 g/kg、47.06 mg/kg;全磷、有效磷含量在高大种植点最高,分别为1.11 g/kg、30.17 mg/kg;全氮含量最高的种植点为高岭,为3.02 g/kg。对比5个地区的土壤成分可以发现,碱解氮与有效磷含量的变异系数达到了94.00%,说明这2种成分在不同的土壤中差别较大,变异系数最小的为pH值,说明在不同种植地土壤中变化较小。速效钾、全磷、全钾、全氮、有机质含量的变异系数范围在19%～55%之间,说明这5个指标在不同种植点土壤中具有较大差别。通过对比虾板与高岭种植点的土壤成分发现,在高岭种植点土壤中,除有效磷、全钾含量外,其他指标均高于虾板种植点,全氮与有机质的含量更是明显高于虾板地区且远高于5个种植点的平均值。

表5 从江县不同种植点土壤肥力成分含量

为了研究土壤成分对香味挥发性物质的影响,对土壤成分与香味挥发性物质的相关性进行分析。结果表明,土壤中全氮含量与2-AP、壬醛、庚醛呈显著正相关,有机质含量与2-AP、壬醛、辛醛呈显著正相关,pH值与正己醇呈显著正相关,全钾含量与己醛、戊醛、异丁醛、2-甲基丁醛呈显著正相关,全磷含量与糠醛呈显著正相关,有效磷含量与糠醛呈显著正相关,全钾含量与糠醛呈显著负相关,有效磷含量与异丁醛呈显著负相关(表6)。

表6 土壤养分与挥发性物质相关性分析结果

3 讨论与结论

稻米能否产生香味通常取决于其体内的Badh2基因是否发生突变[16]。Badh2基因的突变类型有很多,现已发现17个突变类型,最常见的为在第7外显子所发生的8碱基缺失以及3碱基替换,从而造成2-AP的积累[17]。 通过对苟当3号的Badh2基因组进行全长测序基本证实了苟当3号之所以会产生香味是由于其Badh2基因第7外显子发生突变导致2-AP积累引起的。

除受基因影响外,生长环境也对稻米的香味起重要作用,其中土壤环境最为关键,土壤中的全氮、有机质含量在很大程度上影响着稻米的香味[18]。在全氮含量高的地区同一品种的稻米通常会比其他种植点的稻米更具有香气[19-20]。氮肥能够提高植株体内的氮含量,利于促进氨基酸的合成,氨基酸是2-AP合成的重要组分,因此增加氮肥有利于提高稻米中2-AP的含量[21-22]。海拔高度会影响环境的温度、光照等条件从而影响稻米香味的浓度[23]。对不同地区苟当3号2-AP含量进行检测,发现2-AP浓度会随着种植点的升高而随之增高同时稻米的香味也会增加,说明海拔高度对2-AP浓度具有一定的影响。土壤养分与稻米挥发性物质含量相关性分析结果表明,土壤中全氮、有机质含量与2-AP浓度呈显著正相关,当土壤中全氮、有机质含量升高时2-AP的浓度也会随之升高,并且稻米的香味也会增加。在高岭种植点土壤中全氮含量较高,进而促进了2-AP的合成,使该地点的稻米香味更加浓郁,该结果与佟天一等所研究的氮肥对香稻影响的结果[24]基本吻合。同时通过土壤养分与稻米中挥发性物质含量相关性分析发现,全氮含量与4-氨基丁醛呈显著正相关而与γ-氨丁基酸相关性不显著。4-氨基丁醛为2-AP合成的前体物质而γ-氨丁基酸是Badh2基因正常无突变的情况下由4-氨基丁醛转化而来,经检测发现 4-氨基丁醛含量的上升并未导致γ-氨丁基酸含量的增加,表明苟当3号会产生香味的原因是Badh2基因发生了突变。

香稻中挥发性成分复杂多样,可达200多种,其中具有香气的近100种,主要为醛类、醇类、酯类、酮类、烃类以及酚类[25-26]。在苟当3号稻米中所测出的挥发性物质共有16种,其中醛类物质最多,且醛类物质中戊醛、庚醛、己醛、壬醛含量较为突出,这些物质对稻米的香味都具有重要影响。醛类物质阈值很低且对稻米香味有重要影响[27-28]。在检测到的挥发性成分中我们发现了一个重要的化合物——壬醛。该物质与2-AP具有十分相似的气味,并且在稻米中的含量也是随着种植点海拔的升高而逐渐增高。土壤养分与稻米挥发性物质含量相关性分析结果表明,壬醛与全氮、有机质含量呈显著正相关。2-AP浓度与挥发性物质相关性分析结果表明,2-AP浓度与4-氨基丁醛、壬醛含量呈极显著正相关。4-氨基丁醛为合成2-AP的前体物质,与2-AP浓度呈正相关,壬醛与2-AP有着相似的气味并且与全氮、有机质含量呈显著正相关,因此影响稻米苟当3号香味的另一因素就是稻米中壬醛的含量。

本研究对苟当3号的Badh2基因进行全基因组测序发现在第7外显子处发生了3 bp突变以及 8 bp 缺失,该突变会造成2-AP的积累。经研究发现,稻米中壬醛的含量也对稻米的香气有一定的影响,因此造成苟当3号香味差异的主要成分是稻米中2-AP与壬醛的含量。同时结合土壤基本养分与香味挥发性物质含量的分析来看,稻米香味主要受土壤中全氮、有机质含量的影响,因此可以通过改善土壤中有机质、全氮的含量从而进一步提高苟当3号的香味浓度。