玉米南方锈病抗性机制及抗病育种研究进展

张军刚, 郭海斌, 许海涛, 冯晓曦, 许 波, 王成业

(驻马店市农业科学院/河南省玉米产业技术体系驻马店综合试验站,河南驻马店 463000)

玉米用途广泛、种植简单,是我国目前种植面积最大、产量最高的作物,在我国农业经济中占有重要的战略地位。因此,玉米的安全生产对于保障粮食安全和经济发展有重要意义。玉米南方锈病是由活体营养型真菌多堆柄锈菌侵染而引起的一种气流性传播病害,主要发生在热带、亚热带玉米种植区[1]。该病害在我国首次发现于海南省乐东县,目前已蔓延至广东、广西、河南等22个省份,逐渐成为我国黄淮海夏玉米生产区和南方玉米生产区的主要病害[2-4]。

玉米南方锈病主要发生在生长后期,危害玉米叶片,病害暴发流行时,感病叶片被夏孢子堆覆盖,严重影响叶片的光合作用,导致叶片干枯死亡,籽粒灌浆提前终止,造成减产。Rodriguez-Ardon等进行了多堆柄锈菌侵染抗感近等基因系试验,结果显示,南方锈病最高可使玉米产量减少45%[5]。随着全球气候变暖,玉米南方锈病在北半球的发生区域呈扩大趋势[6],我国的玉米生产面临着更严峻的挑战。虽然可以通过杀菌剂防治南方锈病[7-8],但南方锈病发生具有暴发性、间歇性,防治困难,还会造成环境污染,增加成本。因此,选育并推广种植高产抗病品种是防控玉米南方锈病最经济、有效的措施。

1 病原生物学和病害流行学

1.1 南方锈病病原菌研究现状

多堆柄锈菌于1891年在美国阿拉巴马州首先被发现,1897年正式定名[9]。夏孢子淡黄色至金黄色,单胞,近球形,大小为(23～30) μm×(28～37) μm,表面着生有密集的刺突,赤道线上有4～5个发芽孔,夏孢子进一步萌发,形成夏孢子堆及次生夏孢子堆,产生“卫星孢子堆”现象。冬孢子仅偶尔在晚熟玉米植株上发现,性孢子期与锈孢子期未详[2,10]。

多堆柄锈菌存在明显的生理分化现象。先后在非洲和美洲鉴定到10个生理小种,分别为EA.1[11]、EA.2[12]、EA.3[13]、PP.3～PP.8[14]、PP.9[15]。由于2份多堆柄锈菌生理小种鉴别寄主的丢失,因此对多堆柄锈菌生理小种的鉴定遇到困难[16]。Casela等在1999—2000年利用50个杂交种对采自巴西4个地区的60份多堆柄锈菌进行鉴定,获得17个毒力型[17]。2008年,Dolezal等在美国乔治亚州发现对Rpp9基因有毒力的新菌株[18]。Unartngam等利用5对简单重复序列区间(ISSR)标记对采自泰国的36份多堆柄锈菌样品进行多样性分析,结果将多堆柄锈菌划分为13个群,显示菌群具有良好的遗传多样性[19]。邢国珍采集河南、海南和重庆的菌株进行序列比对,发现3个地区病菌的遗传多样性不丰富,并且没有明显的亚群体遗传分化[20]。而郭云燕等的研究表明,病菌的遗传变异与地域及年份均有关系[16,21]。

1.2 病害流行条件

玉米南方锈病的发生和流行是寄主植物、病原菌、环境因素相互作用的结果。目前,推广的一些玉米品种大多感病是病害流行的主要原因[22-23]。多堆柄锈菌不能在我国北方玉米种植区越冬而形成一个完整的侵染链,病原菌的初侵染源主要由不定期形成的热带气旋和西南季风所携带,因此南方锈病的发生具有不确定性[24]。关于环境因素方面的研究较多。杨雪等研究发现,玉米南方锈病的发病温度为15～31 ℃,最适发病温度为24～27 ℃[25]。鄢洪海等的研究表明,玉米南方锈菌最适宜的孢子萌发湿度是在水膜中,相对湿度低于90%时很少萌发;最适宜温度为26～28 ℃,低于14 ℃和高于 34 ℃ 时几乎不萌发[23]。Hollier等的研究表明,26 ℃ 16 h为多堆柄锈菌侵染玉米的最适条件,低于 12 ℃ 和高于 36 ℃ 不萌发[26]。夏孢子萌发对光不敏感[27];萌发的pH值范围为3～10,最适pH值为7;碳(C)源可以促进夏孢子的萌发,氮(N)源抑制夏孢子的萌发[28]。适宜的发病条件下,玉米全生育期接种均可发病,苗期最易感病,随着生育期的增长感病性降低[29]。

2 玉米抗南方锈病种质资源的鉴定与筛选

通过田间自然感病或接种病原菌等方法从大量的材料中鉴定筛选抗性资源,是玉米核心骨干种质抗性改良和抗病品种选育的基础,也为抗病基因挖掘提供了宝贵的遗传材料。在抗南方锈病种质资源鉴定筛选上,国内学者利用人工接种病原菌和自然田间发病对来源广泛的玉米种质资源进行抗性筛选和评价,筛选出部分抗性良好的种质。李石初等运用人工接种病原菌的方法,从1 218份玉米材料中,筛选出24份对南方锈病表现高抗的材料,如齐319、X178、辽2202、K36等,占鉴定材料的1.97%[30]。黄飞燕运用人工接种病原菌的方法,从国家种质资源库收藏的1 136份玉米种质资源中筛选出高抗材料28份,抗病材料81份,中抗材料340份[31]。江凯等采用人工接种病原菌的方法,从 1 589 份玉米材料中筛选出26份高抗南方锈病的材料,如X178、辽2202、K36、SW-40、八十天、老来秕等[32]。杜青等对379份玉米种质资源经过人工接种鉴定,在来自国际小麦玉米改良中心的352份玉米自交系中,表现为高抗和抗的自交系共243份;15份玉米杂交种中,表现为抗或中抗的有10份;12份温带自交系中,表现为高抗和抗有的2份,为P138和X178[33]。韩丽苹通过田间人工接种鉴定,在103份自交系中筛选出9份高抗材料(S37、P178、CML305、CML307、CML411、CML470、CML496、CML497和K22)和16份抗病材料(P138、526018等)[34]。姚国旗等在引进的34份热带、亚热带自交系中鉴定得到11份南方锈病抗性新种质[35]。陈文娟等运用人工接种的方法,从903份玉米材料中,筛选出丹3130、164、冀186等高抗南方锈病的种质8份、抗病材料29份、中抗材料100份[36]。Zhou等在对253个玉米自交系进行2年2地南方锈病抗性鉴定,18个自交系(43.7、DH02、Zheng39、T2、JH3372等)抗性表现与对照齐319相同或显著高于对照[37]。刘秀峰等在海南对161份玉米自选种质进行南方锈病抗性鉴定,其中100份表现为高抗和抗,未发现对玉米南方锈病免疫的种质材料[38]。蒙成等通过人工接种病原菌,在76份外引改良玉米自交系中筛选出宝335、M36、东正1、太99-2等高抗玉米南方锈病5份[39]。段灿星等于2016—2019年间在田间自然发病条件下对2 000份遗传背景丰富的玉米种质资源进行多年多点的抗病性鉴定,由于各个鉴定圃均未充分自然发病,因此,调查数据不能真实体现种质的抗性水平,抗病种质的数据仅供参考[40]。田耀加等结合人工接种病原菌和田间自然发病对710份鲜食玉米自交系材料进行南方锈病抗性鉴定,仅有3份糯玉米材料、1份甜玉米材料和1份甜加糯玉米材料共5份材料高抗南方锈病[41]。陈文娟等进一步利用分子标记对筛选到的抗性种质进行了遗传多样性分析并在此基础上进行聚类分析(表1)[36,42],可以为抗病育种中合理利用抗源提供信息,加快抗病新品种的选育。

表1 部分抗源杂种优势群分类

综上,学者们经过多年努力,筛选、创制了不少玉米南方锈病抗源,但多数抗源为热带、亚热带引进种质和农家种,可直接利用的温带种质较少。由于热带、亚热带种质和农家种农艺性状较差无法直接利用,且材料创新周期长、难度大,在育种上成功利用的较少。如果能够充分研究和利用这些抗性资源,将会丰富抗性材料的多样性,促进玉米抗南方锈病遗传育种取得进展。

3 玉米对南方锈病的抗性遗传

关于玉米南方锈病的抗性遗传,不同的亲本遗传材料具有不同的抗性遗传特性,有的表现为单基因控制的质量性状遗传,有的表现为多基因控制的数量性状遗传。姚国旗等用不同的自交系进行了玉米对南方锈病的抗性遗传研究,结果表明,玉米对南方锈病的抗性遗传方式因自交系而异[35]。Zummo等研究认为,玉米对南方锈病表现为部分抗性,抗性水平可用病斑严重度、病斑大小、病斑肿胀度和孢子形成来评价[43]。王文洁等以自交系K381(抗病)和LX9801(感病)以及由它们配制的F1、F2、F3、BC1F1、BC2F2几个世代的发病情况进行统计分析,推测K381携带的抗性基因为显性单基因[44]。杜青等的研究表明,对玉米南方锈病抗性遗传以加性效应为主,同时具有一定的非加性效应,抗性表现受环境影响较大[45]。由于所选用试验材料的不同或所利用的病原菌菌株差异,试验结果不尽相同,因此明确抗性种质对南方锈病的抗性遗传机制,对于抗性基因/数量性状基因座(QTL)的发掘与精细定位,开展分子标记辅助育种、提高育种效率具有重要的促进作用。

4 玉米对南方锈病的基因/QTL定位

根据对不同多堆柄锈菌生理小种的抗性差异,国际上已经发现的玉米南方锈病抗性基因有11个,分别为Rpp1～Rpp11。Rpp1是在材料AFRO.29中鉴定到的,对生理小种EA.1表现为专化抗性,为完全显性基因;Rpp2是在材料AFRO.24中鉴定到的,对生理小种EA.1和EA.2都具有抗性,为不完全显性基因,经验证这2个基因并非等位基因[46]。Rpp3～Rpp8是利用11个玉米材料对生理小种 PP.3～PP.8的抗性差异而推导出的抗病基因[14]。Rpp9是在玉米种质PI186208中鉴定出对生理小种PP.9表现抗性的显性单基因[15]。Rpp10是从哥伦比亚种质Andaqui中分离到的兼抗EA.1和EA.3的完全显性基因;Rpp11是从墨西哥玉米种质Zapalote Chico中分离到的不完全显性基因,试验杂交没有证明Rpp1、Rpp10和Rpp11基因之间存在连锁关系[13]。Futrell等在南非种质B1138T中发现一个对PP.9表现专一抗性的抗病基因,但是尚未发现是否与Rpp9连锁[47]。Chávez-Medina等研究发现,种质PI186215携带的抗病基因与Rpp9连锁,种质PI186209携带的抗病基因为隐性且为Rpp9的等位基因[48]。

目前,我国也鉴定到部分对南方锈病表现出抗性的抗病基因,但不是对具体生理小种的抗性,而是对混菌的抗性。Chen等将抗病自交系齐319携带的单显性抗病基因RppQ定位在第10号染色体短臂上,与简单重复序列(SSR)标记phi 041和扩增片段长度多态性(AFLP)标记AF1之间的遗传距离分别为2.45、3.34 cM[49]。Zhou等进一步将RppQ定位在特定序列扩增(SCAR)标记MA7和AFLP标记 M-CCG/E-AGA157之间,与2个标记的距离分别为0.46、1.71 cM[50]。刘章雄等利用P25和F349构建的F2:3分离群体,将P25携带的抗南方锈病主效基因RppP25定位在第10号染色体,与标记phi059相距5.8 cM[51]。Zhao等将RppP25精细定位于bin10.01上物理距离约40 kb的标记P091和M271之间,并开发了2个共分离标记M214和M019[52]。Zhang等研究发现,抗病自交系W2D携带的抗性基因RppD与SSR标记umc1291和酶切扩增多态性序列(CAPS)标记CAPS858分别相距2.9、0.8 cM,与RppQ和RppP25这2个抗病基因紧密连锁[53]。姚国旗等将玉米自交系CML470携带的抗南方锈病显性基因RppC定位到第10号染色体短臂端部bin10.00-10.01上,与SSR标记umc1380和umc1291分别相距3.5、8.8 cM[54]。Wu等将抗南方锈病自交系SCML205中的显性抗病基因RppS定位于第10号染色体短臂末端[55]。张小利利用抗病自交系冀库12和感病自交系黄早四的F2 ∶3家系,将冀库12携带的单显性抗病基因Rpp12定位在10号染色体bin10.02上,与标记phi063相距4.2 cM[56]。江凯将抗南方锈病自交系辽2204携带的单显性抗病基因RppL2204定位在第10号染色体短臂顶端,与标记umc1380的遗传距离为9.6 cM[57]。王兵伟等将高抗南方锈病自交系S313携带的抗病基因定位在第10号染色体短臂约0.47 M范围内,其中3个基因LOC103640657、LOC100191493、LOC103640673为高抗玉米南方锈病的抗性候选基因[58]。Wang等以京2416与抗锈京2416(京2416K)构建F2群体,将显性抗病基因RppM定位在第10号染色体短臂110 kb区间内。其中,2个基因Zm00001d023265和Zm00001d023267功能预测编码假定的CC-NBS-LRR(coiled-coiled,nucleotide-binding site,and leucine-rich repeat)蛋白,且在抗、感亲本中存在序列及表达量的差异,为RppM的候选基因[59]。

在抗南方锈病的数量性状位点定位方面,在玉米10条染色体上均定位到QTL。Brewbaker等在Hi27的近等基因系群体中将抗南方锈病QTL定位在第2、第3、第7号染色体上[60]。Holland等利用抗病自交系1416-1、1497-2 和感病杂交种B73Ht×Mo17Ht杂交衍生的F2 ∶3家系,将抗南方锈病QTL定位在第3、第4、第10号染色体上,位于第10号染色体短臂上的位点,bnl3.04可以解释82%～83%的表型变异[61]。Jines等利用NC300和B104为亲本构建的重组自交系群体,将抗病QTL定位在第4、第8、第9、第10号染色体,位于第10号染色体短臂上的一个主效QTL解释了83%的表型变异[62]。Wanlayaporn等利用甜玉米种质hA9104和hA9035衍生的重组自交系群体在第1、第2、第5、第6、第9、第10号染色体上定位到15个抗南方锈病QTL,每个QTL可解释6.1%～41.8%的表型变异[63]。Deng等利用CML486和Lx9801构建的重组自交系群体在第4、第9、第10号染色体定位到3个QTL(qSCR4.08、qSCR9.04和qSCR10.06)[64]。陈文娟等利用W456(抗病)和黄早四(感病)的杂交F1和F2群体,在第3、第7、第8、第9、第10号染色体上共定位到6个抗南方锈病QTL,其中,位于第10号染色体短臂上的位点qSCR10效应值最大,可以解释24.19%的表型变异[65]。Deng等利用CIMBL83和Lx9801构建的重组自交系群体,将抗南方锈病的主效QTL位点qSCR4.01精细定位于第4号染色体770 kb区间,可解释48%～65%的表型变异[66]。Lu利用齐319和掖478构建的重组自交系群体,在第3、第5、第6、第9、第10号染色体上定位到5个抗南方锈病QTL(qSCR3.04、qSCR5.07、qSCR6.01、qSCR9.03和qSCR10.01),每个QTL可解释2.84%～24.15%的表型变异。其中,抗南方锈病主效QTLqSCR6.01,在标记Y6q77和Y6q79之间,物理距离为77.6～79.6 Mb,是首次在第6号染色体上鉴定的抗南方锈病主效QTL[67]。艾堂顺等利用P178(抗病亲本)和G41(感病亲本)构建的BC2F5群体,在玉米第2、第5、第6、第10号染色体上共鉴定出5个QTL,并将抗南方锈病主效QTLqSCR10.01定位于标记UMC1380和C(10)3595071之间,标记间的物理距离为 1.34 Mb[68]。Lv等利用CML496和Lx9801构建的重组自交系群体,定位到3个抗南方锈病QTL,分别位于第3、第9、第10号染色体上,其中位于第10号染色体bin10.00/10.01的RppCML496可解释43%～78%的表型变异[69]。Mu等以抗感自交系L119A和Lx9801构建BC4F2群体,利用混合分组测序分析(BSA-seq)技术在第1、第6、第8、第10号染色体上检测到8个QTL,其中主效QTL(QTL8)位于10号染色体上,且该区间有25个候选基因,其中2个基因(Zm00001d023265和Zm00001d023267)属于CC-NBS-LRR类型的抗病基因。这2个基因与RppM的候选基因相同,QTL8与RppM是否为同一个基因,还需要进一步研究[70]。

全基因组关联分析作为研究复杂数量性状相关基因定位的有效工具,在挖掘抗玉米南方锈病基因研究方面也取得了进展[71]。Camacho等对164个热带玉米自交系在2个生长季节下进行南方锈病的抗性鉴定,结合通过测序进行基因分型(GBS)技术进行关联分析,在第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10号染色体上检测到与南方锈病抗性相关联的8个单核苷酸多态性(SNP)[72]。2015—2016年,Zhou等分别在三亚市、南通市对253个玉米自交系进行南方锈病抗性鉴定,利用The Maize SNP3K Beadchip中等位基因频率大于5%的2 824个SNP标记进行关联分析,在第4、第8、第10号染色体上检测到与南方锈病抗性相关联的7个SNP[37]。Sun等对689个温带玉米种质在美国内布拉斯加东部地区进行南方锈病抗性鉴定,全基因组关联分析研究在第2、第4、第6号染色体上确定了4个与南方锈病严重程度显著变化相关的位点,并在相关位点筛选到与抗病相关的候选基因[73]。

综上所述,目前发掘和定位的抗南方锈病主基因均位于玉米10号染色体的短臂上。南方锈病的数量抗病性一般是由一个主效QTL和多个微效QTL共同控制。部分抗病基因已经筛选出紧密连锁的分子标记及候选基因,为分子标记辅助选择育种及基因克隆奠定了基础。

5 玉米对南方锈病的抗性机制研究

玉米对南方锈病的抗性发生在细胞被侵染之后,玉米表皮结构不决定抗性的强弱,抗病材料细胞内菌体发育进程缓慢,菌体生长受到明显抑制[74]。黄飞燕等对不同抗性玉米自交系人工接种多堆柄锈菌后,发现苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶与抗病相关,可溶性糖与感病相关[75]。Wang等利用基因芯片技术对抗病品种鲁单981早期响应多堆柄锈菌接种进行分析,结果表明,植株中6个WRKY转录因子全部上调表达,诱导防御和活性氧代谢相关基因参与玉米对南方锈病的抗性反应[76]。Wang等利用比较蛋白质组学分析,鉴定到1个编码remorin 蛋白的抗南方锈病相关基因ZmREM1.3,转基因结果表明,该基因正向调控玉米对南方锈病的抗性,可能通过水杨酸(SA)/茉莉酸(JA)信号途径调控玉米对南方锈病的抗性[77]。Mu等利用 RNA-seq技术,对抗感材料L119A和LX9801接种多堆柄锈菌后进行分析,结果发现,S型木质素在抗玉米南方锈病中可能起关键作用;高抗自交系L119A在接种后的差异表达基因中有大量WRKY及MYB等转录因子,而参与防御反应和代谢过程的基因也被显著富集。其中,苯丙烷和黄酮类代谢物的生物合成途径富集最为明显[70]。Sun等利用全转录组关联分析筛选到1个位于第6号染色体 8.6 Mb 的RNAse E/G-like protein (RNE)基因Zm00001d035185,其表达水平与南方锈病严重程度的变化显著相关,但是没有进行进一步的研究来验证此基因的功能[73]。

克隆抗性基因可以阐明玉米抗南方锈病的分子机制。Deng等采用图位克隆方法,从抗病自交系CML496中分离到了1个编码含有核苷酸结合结构域和富含亮氨酸重复序列的蛋白类的抗玉米南方锈病基因RppC;在此基础上,结合转录组分析和玉米原生质体超敏反应筛选体系等方法从多堆柄锈菌基因组中鉴定到RppC识别的效应因子AvrRppC,并证明了两者之间存在互作;并发现新的病原菌生理小种以AvrRppC氨基酸突变的方法来逃避RppC的识别。表明RppC/AvrRppC的互作方式符合经典的“基因对基因”学说的互作模型[78]。Wang等从玉米祖先种大刍草中克隆了1个多重抗病性基因ZmMM1,该基因对玉米大斑病、南方锈病和灰斑病均表现抗病,并鉴定到1个正向调控ZmMM1表达水平的序列qLMchr7C117。qLMchr7C117能够响应并影响病原相关分子模式触发的免疫的信号;ZmMM1编码1个含MYB-DNA结合域的转录抑制因子;ZmMM1蛋白通过抑制基因ZmMT3的转录水平,增强了玉米植株体内活性氧的积累,正向调控玉米对多种病害的抗性[79]。

6 玉米对南方锈病的抗病育种

选育抗病品种是预防南方锈病危害最经济、有效的措施。利用抗性种质对国内广泛使用的骨干自交系进行抗性改良是抗玉米南方锈病种质资源创新的主要途径之一,并以此进行强优势杂交组配得到高抗性品种[80]。杜青等研究认为,在南方锈病抗性育种中应该采取轮回改良、鉴定与选择同步的策略,在较大南方锈病选择压力下从早期世代中选择抗病材料[45]。由于该病害间歇性发生,因此常规育种过程中,在缺乏病害选择压力的情况下,抗病基因难以表达,造成抗病基因的丢失,这也是目前育种工作者使用的玉米自交系大多数感染南方锈病的主要原因之一[44]。分子标记辅助选择利用与抗病基因紧密连锁的分子标记直接对后代材料进行基因型选择,不受环境条件和病害发生的影响,可快速创制玉米抗南方锈病材料。张斌利用分子标记辅助选择将抗体材料齐319中的高抗南方锈病基因RppQ导入广泛使用但感南方锈病的郑58、昌 7-2、9801等自交系中,通过回交育种,选育出了抗病性强的改良后代材料[81]。李少博等以齐319为供体材料,通过分子标记辅助选择将抗病基因导入感南方锈病自交系京24,结合回交转育技术,鉴定到部分表现抗性的BC1代植株[82]。谭华等采用来自国际玉米小麦改良中心(CIMMYT)的抗性材料对温带感病种质进行改良,利用分子标记辅助选择在BC2F2代群体中筛选到235株达到高抗及抗水平的植株[83]。Wang等在小麦中鉴定到1个被条锈菌效应子操纵的感病基因TaPsIPK1,利用CRISPR-Cas9 编辑技术敲除TaPsIPK1基因获得了对小麦条锈病表现广谱抗性的编辑植株,且不影响其他主要的农艺性状[84]。这一研究成果为创制抗玉米南方锈病新种质提供了新思路。

7 展望

目前,虽然在玉米南方锈病抗性资源筛选、抗病基因/QTL定位、抗病机制和抗性新品种培育方面取得了阶段性进展,但仍不足以支撑玉米的安全生产,南方锈病的研究工作还需进一步加强。一是加快病原菌的全基因组测序工作。病原菌多堆柄锈菌的全基因组测序工作尚未完成,分离和鉴定病原菌中的相关致病基因,从分子水平研究致病基因作用及调控机制工作仍为空白。病原菌的全基因组测序工作将为明确玉米南方锈病病菌致病机制、南方锈病的防治及抗性品种选育提供理论基础。二是加强南方锈病抗性资源的收集、筛选和利用。对国内种质资源开展多年多点的南方锈病抗性鉴定,从中筛选具有稳定抗性的种质资源,同时积极引进热带、亚热带抗性资源对本土骨干自交系进行抗性改良。三是加强抗性基因的定位和分子标记的开发。挖掘种质资源中的抗性基因,应结合连锁分析、关联分析等方法对抗病基因进行精细定位、克隆,开发诊断型分子标记,采用分子标记辅助选择将抗性基因/QTL从农艺性状较差的抗源中导入农艺性状优良的骨干系中,获得农艺性状优良且抗病性强的材料进一步用于育种。四是加强玉米对南方锈病抗性机制研究。运用高通量测序技术,结合分子生物学、生物信息学等分析方法,利用基因编辑、基因沉默等方法分析寄主与病原菌互作机制,了解南方锈病抗性机制,为抗性资源的有效利用奠定基础。