丁苯那嗪调节TH 和突触囊泡转运改善HD 的机制研究

王如意，范晶菁，李洪林，王 蕊

（华东理工大学药学院, 上海市新药设计重点实验室, 上海 200237）

亨廷顿舞蹈症（Huntington's disease, HD）作为神经退行性疾病中最主要的单基因遗传病，主要由基因突变引起[1]。其临床症状表现为舞蹈症、肌张力障碍、认知功能减退及抑郁等[1]。亨廷顿蛋白（Htt）参与囊泡转运动力学、突触传递和自噬调节等[2]，在神经系统的胚胎形成、神经元存活和信号转导等方面发挥重要作用。研究表明，突变的Htt 蛋白（mHtt）诱导纹状体神经元损伤，导致神经元丢失。神经元的丢失使得纹状体中多巴胺（DA）水平紊乱[3]，进而破坏大脑中所有神经递质的平衡，导致纹状体功能障碍[4]，最终引起运动损伤[5]。3-硝基丙酸（3-NP）通过血脑屏障，结合并抑制线粒体上琥珀酸脱氢酶的催化位点，抑制三羧酸循环，从而选择性损伤纹状体神经元，使动物表现出与HD 相似的病理改变和运动症状[6]。因此，3-NP 诱导的HD 大鼠模型被广泛用于该疾病的研究。

丁苯那嗪（TBZ）是一种非典型抗精神病药，具有降低单胺类神经递质的作用[7-8]，已被广泛用于治疗精神病、运动障碍以及中枢功能障碍等疾病[9-10]。据报道，TBZ 对舞蹈样症状具有暂时的抑制作用[11]，然而，其对3-NP 诱导的HD 样症状及病理改变的作用机制尚未完全揭示。

本文通过建立3-NP 诱导的HD 大鼠模型，证实了TBZ 可缓解3-NP 引起的大鼠体重下降和运动功能障碍，并着重研究了其改善舞蹈样症状的机制。实验结果表明，TBZ 通过降低囊泡单胺转运体2（VMAT2）的表达和对突触的保护作用调节DA 的突触囊泡转运过程，减少纹状体中DA 的转运和释放。同时，TBZ 通过抑制酪氨酸羟化酶（TH）的表达降低DA 在纹状体中的合成。通过上述两种作用共同减少纹状体中DA 水平，减少神经元损伤，保护纹状体正常功能，从而改善HD 样症状。本文通过对TBZ 治疗3-NP 诱导的HD 大鼠模型的药效及机制研究，验证了其治疗HD 的可行性，研究结果为HD 的治疗策略提供了新的方向。

1 实验部分

1.1 试剂和药物

3-NP（N5636-1G，纯度≥97%）购自美国Sigma-Aldrich 公司，溶于生理盐水中，用NaOH 调节pH 至7.4；TBZ（T2839-200MG，纯度99%）购自日本TCL 公司；Htt 抗体和突触素（SYN）抗体均购自美国Millipore公司；TH 抗体购自美国Cell Signaling Technology 公司；VMAT2 抗体和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体均购自美国Proteintech 公司；免疫组化二抗试剂盒和二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒均购自武汉赛维尔有限公司；荧光二抗IgG、蛋白酶抑制剂和化学发光试剂盒（ECL）均购自Thermo Scientific 科技（中国）有限公司；DA 检测试剂盒和HVA检测试剂盒购自中国Cusabio 公司；尼氏染色试剂盒和苯甲基磺酰氟（PMSF）购自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1动物模型建立 雄性Wistar 大鼠，200～300g，购自上海西普尔必凯实验动物有限公司。

将大鼠随机分为3 组：生理盐水组；3-NP组（注射剂量20mg/kg[12]）；3-NP+TBZ 组（3-NP、TBZ 注射剂量分别为20、3mg/kg[13]）。实验流程如图1 所示。预给药1 周后，腹腔注射3-NP 或生理盐水，连续5d。5d 后进行行为学测试。1.2.2 体重测量 每天在给药前，于同一时间称取大鼠的体重并记录，按体重计算每日给药量，取第1 d 和最后1 d 的体重计算其体重变化率。体重变化率（Δmw）计算公式如下：

图1 实验流程示意图Fig.1 Experimental flow chart

其中，m'、m1分别为最后1 d 和第1 d 的体重。

1.2.3转棒实验 通过转棒实验测试大鼠的平衡能力。在实验第12d 进行转棒实验，正式测试之前，所有大鼠接受为期3d 的训练，转棒转速为4r/min，每天3 次，每次训练3min。正式实验中，转棒从4r/min到20r/min 加速旋转，记录大鼠从转棒上掉落的时间，重复3 次，取平均值用于比较分析。

1.2.4强迫游泳实验 转棒实验结束后，将大鼠置于安静的环境中休息3h，以消除对后续实验的干扰。随后进行强迫游泳实验，将大鼠分别放入直径25cm、水深30cm 的有机玻璃桶中，水温为(25±3)℃，让其游泳6min，记录后5min 大鼠的不动时间。当动物停止挣扎，仅为了保持平衡或漂浮而运动时，就认为其处于不动状态。

1.2.5Westernblot 实验 大鼠处死后解剖、分离其纹状体。在含有PMSF和蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中裂解组织。提取后的蛋白用BCA 试剂盒进行蛋白定量。在100 V 电压下，经过φ=10%的分离胶分离，并转膜至PVDF 膜上。封闭2 h 后，将条带分别与Htt 抗体（体积比1∶1000）、TH 抗体（体积比1∶1000）或VMAT2 抗体（体积比1∶1000）于4 ℃下过夜孵育；洗膜，室温下与GAPDH 抗体（体积比1∶10000）孵育2 h。通过化学发光检测液显色，于化学发光成像仪（Tanon 5200s 型）下曝光显影。用ImageJ软件对条带进行定量。

1.2.6尼氏染色 大鼠麻醉后依次经心脏灌注50mL生理盐水和100mLφ=4%的多聚甲醛，分离脑组织保存于φ=4%的多聚甲醛中。酒精梯度脱水，石蜡包埋，以4μm厚度切片。切片脱蜡后于尼氏染色液中孵育10min，酒精梯度脱水，二甲苯脱色后用中性树脂封片。

1.2.7免疫组化 石蜡切片脱蜡，于柠檬酸抗原修复液中热修复，φ=3%的过氧化氢中孵育25min 以去除内源性过氧化物酶。切片于φ=5%山羊血清中封闭30min，加入Htt 抗体（体积比1∶1000）或TH 抗体（体积比1∶3000）于4℃条件下过夜孵育。磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3 次后，将切片与生物素标记的羊抗兔IgG 或羊抗鼠IgG 于37℃孵育1h。二氨基联苯胺（DAB）工作液进行显色，观察到阳性位置出现棕黄色后，用PBS 结束显色。酒精梯度脱水后，浸入二甲苯中使其透明。稍晾干，中性树脂封片。

1.2.8免疫荧光 一抗孵育前步骤与免疫组化相同，加入突触素SYN 抗体（体积比1∶200）于4℃中避光过夜孵育。洗涤3 次，室温下加入AlexaFluor®568山羊抗鼠（体积比1∶100）避光孵育2h。加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液孵育1min。PBS冲洗后，使用尼康共聚焦显微镜（Nikon-csu-w1sora型）观察切片，设置激光波长为（405～561）nm。使用imageJ 软件统计荧光强度。

1.2.9酶联免疫吸附实验（ELISA）

（1）样品制备 取适量纹状体组织，PBS 冲洗血迹。加PBS 研磨至匀浆状，于−20℃条件下放置过夜。反复冻融2 次以破坏细胞膜，在5000g，2～8℃条件下离心5min，分离上清。

（2）DA 水平检测 用DA 检测试剂盒检测纹状体中的DA 水平。加入标准品或样品，于37℃孵育2h，弃液。每孔加入生物素标记抗体工作液，于37℃孵育1h，洗涤。每孔加入辣根过氧化物酶标记亲和素工作液，于37℃孵育1h，弃液，洗涤。依次加入底物溶液，于37℃避光孵育15～30min。加入终止液停止反应。用酶标仪于450nm 下测定各孔的光密度。使用BCA 试剂盒蛋白定量进行归一化处理。

（3）HVA 水平检测 用HVA 检测试剂盒检测纹状体中HVA 水平。加入标准品或测试样品，立即添加抗体工作液，于37 ℃孵育40 min。洗涤，加入酶结合物工作液，于37 ℃ 温育30 min。洗涤，每孔加入底物溶液，于37 ℃避光显色20 min。依次加入终止溶液终止反应。用酶标仪于450 nm 处测量各孔的光密度值。使用BCA 试剂盒蛋白定量进行归一化处理。

1.2.10数据分析和统计 数据处理及作图采用GraphPadPrism8.0，统计分析采用IBMSPSSStatistics 25，结果以平均值±标准差表示。采用单因素方差分析进行组间差异性比较，其中“*”和“#”分别表示与模型组3-NP 和对照组相比；P<0.05 表示有显著性差异；*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，#表示P<0.05，##表示P<0.01，###表示P<0.001；n表示每组样本数。

2 结果与讨论

2.1 TBZ 逆转3-NP 诱导的体重减少和异常行为表现

体重和行为学变化被用来评估动物模型是否成功。结果表明，经3-NP 诱导后，动物体重较对照组显著下降（P<0.001，图2（a）），这可能与代谢紊乱、神经元变性以及双侧纹状体损伤有关[14]，伴随着体重下降会出现一些运动行为表型的改变[15-18]；在行为学实验中，大鼠从转棒上掉落的时间显著减少（P<0.001，图2（b）），在水中不动时间显著增加（P<0.001，图2（c）），表明运动能力受损，表现出HD 样症状，这些变化可能与3-NP 损伤纹状体功能有关[19]。与3-NP 单独处理组相比，经3-NP+TBZ（3 mg/kg,P<0.001）处理的大鼠从转棒上掉落的时间显著增加，且在杆上运动时四肢更有力，而3-NP 处理组动物则表现出跛行状态。此外，TBZ 减少了动物在水中的不动时间 （P<0.001）。上述结果表明，TBZ 改善了大鼠的运动协调能力和游泳能力，表明TBZ 可以缓解3-NP 诱导的HD 样症状。

图2 TBZ 逆转3-NP 诱导的体重减少和异常行为Fig.2 TBZ reversed 3-NP induced weight loss and abnormal behavior

2.2 TBZ 减轻3-NP 诱导的Htt 蛋白水平的升高

mHtt 蛋白在多种细胞中广泛表达，可引起细胞毒性[20]，但HD 病变主要发生在纹状体[21]。本研究通过Western blot 和免疫组化对动物纹状体中Htt 的表达进行研究，结果如图3 所示。与对照组相比，3-NP 处理组大鼠的纹状体中Htt 水平显著升高（P<0.05，图3（a）、3（b）），这与HD 应有的病理特征相吻合。而TBZ 治疗可以明显逆转Htt 水平的升高趋势（P<0.01）。如图3（c）显示，纹状体Htt 阳性信号呈棕黄色，与对照组相比，经3-NP 诱导的大鼠纹状体中阳性信号密度与强度均明显增加，表明Htt 水平升高。而加入TBZ 可逆转这一趋势，提示TBZ 能降低Htt 的表达，该结果与Western blot 保持一致（图3（c））。上述结果验证了TBZ 可减轻3-NP 诱导的Htt 蛋白水平的升高。

图3 TBZ 减轻3-NP 诱导的Htt 蛋白水平的升高Fig.3 TBZ reverses 3-NP-induced Htt protein upregulation

2.3 TBZ 提高3-NP 诱导的大鼠纹状体和黑质中神经元的存活

mHtt 可能引起兴奋性谷氨酸中毒，并破坏附近神经元或神经胶质细胞的功能，从而损伤神经元[22]。为了验证TBZ 对纹状体神经元的影响，采用尼氏染色法对大鼠纹状体神经元进行形态学分析并计数。如图4 所示，对照组中神经元形态正常且分布均匀，无明显肿胀和核固缩。经3-NP 诱导的大鼠纹状体中神经元数量较对照组减少（P<0.01），且神经元分布不均，胞体呈现皱缩状，且仁不清。经TBZ 治疗后，神经元数量增加（P<0.01），形态趋于正常（图4（a）、4（b））。mHtt 在疾病早期对纹状体神经元造成深度损伤，随后影响大脑其他区域的神经元[23-24]，因此，本研究进一步对黑质神经元的损伤情况进行评估。与纹状体相似，3-NP 处理组中大鼠黑质神经元的数目明显减少（P<0.01），而3-NP+TBZ 组中大鼠黑质神经元的数量明显增加（P<0.05，图4（c））。3-NP 引起神经元丢失和死亡，而TBZ 可减轻3-NP 引起的神经毒性，表明该化合物对3-NP 诱导的HD 大鼠模型具有神经保护作用。

图4 TBZ 提高3-NP 诱导的大鼠纹状体和黑质中神经元的存活Fig.4 TBZ improved 3-NP - induced neuronal survival in striatum and substantia nigra

2.4 TBZ 影响纹状体中DA 及其代谢物的水平

纹状体中神经递质水平的改变已被证明对HD的病理生理基础和疾病的发展有重要贡献[25-26]。本文采用ELISA 法测定动物纹状体中DA 及其代谢物的浓度，验证了TBZ 对神经递质水平的影响。如图5(a)所示，3-NP 诱导的大鼠纹状体中DA 水平显著升高（P<0.05），而其代谢产物高香草酸（HVA）水平明显下降 (图5(b))，提示该动物模型中DA 及其代谢物水平紊乱，表明3-NP 处理组大鼠出现运动障碍可能与引起上述神经递质水平的改变有关。而TBZ处理的大鼠纹状体中DA 水平（P<0.01）较模型组显著下降，HVA 水平明显升高（P<0.05），表明TBZ 可以逆转3-NP 导致的纹状体神经递质紊乱。这可能是TBZ 改善3-NP 诱导的HD 大鼠异常行为表型的原因之一。

图5 TBZ 影响多巴胺及其代谢物的水平Fig.5 TBZ affects the levels of DA and its metabolite

2.5 TBZ 调节TH 的表达水平

采用Western blot 和免疫组化方法检测纹状体中TH 的表达水平。如图6(a) 所示，纹状体的TH 阳性信号为黑质DA 神经元投射的神经末梢，组化染色显示各组均可见棕黄色阳性纤维。与对照组相比，注射3-NP 的大鼠纹状体中TH 阳性纤维密度和信号强度均明显升高。与此相反，TBZ 治疗后纹状体阳性纤维密度降低且信号减弱。统计分析结果显示，3-NP 诱导的动物纹状体中TH 水平高于对照组，但TBZ 处理组大鼠TH 水平显著下降（P<0.01，图6(b))。Western blot 的结果与上述结果一致(图6(c))。因此，TBZ 可调节纹状体中TH 的表达，使其恢复到正常水平。TH 是参与DA 合成的限速酶，抑制TH 可以大大降低DA 的生成[27-29]。TBZ 可能通过抑制纹状体中TH 的表达来降低DA 及其代谢物的含量，从而影响运动表型。

2.6 TBZ 抑制3-NP 诱导的突触损伤并调节VMAT2的表达水平

mHtt 对突触功能具有明显的毒性，如干扰突触囊泡的运输、破坏突触囊泡的结构、抑制神经递质的摄取和释放、影响突触蛋白的表达或转译后修饰[30]。为了验证TBZ 能否通过调节突触囊泡影响中枢神经系统中神经递质的正常释放，本文研究了纹状体中SYN 和VMAT2 的表达。采用免疫荧光法对大鼠纹状体切片进行处理，采用共聚焦显微镜拍摄图像（图7（a））。图7（b）表明3-NP 降低了大鼠纹状体中SYN 水平（P<0.01），说明其对突触具有损伤作用；而TBZ 逆转了3-NP 对突触的损伤（P<0.01），表明TBZ具有选择性地结合并抑制VMAT2 的功能，可以减少囊泡对单胺类神经递质的作用[31]。由图7（c）、7（d）可见，3-NP 处理组中动物纹状体的VMAT2 水平显著高于对照组（P<0.01），而TBZ 能改善这一异常现象（P<0.05），且其改变VMAT2 水平的趋势与改变DA 水平趋势保持一致，表明TBZ 可能通过调节VMAT2 水平影响纹状体DA 的转运和释放。因此，TBZ 可能通过保护突触水平及功能，并调节VMAT2蛋白的表达，恢复纹状体中DA 的含量，其对DA 的调节作用进一步保护了神经元，从而恢复纹状体正常功能，最终缓解了3-NP 诱导的HD 样症状，详细机制过程见图8。

图7 TBZ 抑制3-NP 诱导的突触损伤并调节VMAT2 的表达水平Fig.7 TBZ inhibited 3-NP induced synaptic damage and regulated VMAT2 expression

图8 TBZ 改善HD 样症状的机制示意图Fig.8 Schematic diagram of mechanism of TBZ ameliorating HD-like symptoms

3 结 论

本文验证了TBZ 对3-NP 诱导的HD 大鼠模型的治疗作用，并证实TBZ 可以恢复该动物模型纹状体中发生的DA 及其代谢产物HVA 水平的紊乱，以及降低VMAT2 的蛋白表达，保护突触功能，进而减少单胺类神经递质的转运和释放，调节纹状体中DA 的含量。此外，TBZ 还可以作用于DA 合成路径中的合成限速酶TH，通过抑制该蛋白的表达减少DA 在纹状体中的合成。这些作用共同导致TBZ 降低纹状体中DA 水平，防止DA突触后神经元的过度刺激，减少纹状体功能损伤，从而改善HD 样症状。这可能为TBZ 治疗HD 的机制提供了新的解释。