抗水产病原非O1/O139 霍乱弧菌的中草药筛选及抑菌效果分析

陈圳，钱且奇，李志鹏，徐静雯，张紫瑞，姜群，张晓君，高晓建

（扬州大学动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009）

非O1/O139霍乱弧菌（non-O1/O139Vibrio cholerae）属于弧菌科（Vibrionaceae）弧菌属（Vibrio），广泛分布于江河、湖泊、海洋等水环境中，是引发罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）[1]、日本沼虾（Macrobrachium nipponense）[2]、斑节对虾（Penaeus monodon）[3]、凡纳滨对虾（Penaeus vannamei）[4]、泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）[5]、鲤（Cyprinus carpio）[6]、湘华鲮（Sinilabeo decorus tungting）[7]、异育银鲫（Carassius auratus gibelio）[8]等水产动物疾病的重要病原，对水产养殖危害较大。该菌还能引起人类急性腹泻等疾病[9]。目前，养殖生产中仍主要通过抗菌药物及消毒剂等化学药物防治细菌性疾病，造成水环境污染、水产品药物残留等问题，严重威胁了环境安全和人类健康，并且产生的耐药菌给水生动物细菌性病害防治带来了诸多困难[10]。水产养殖中亟需寻找安全、有效的抗生素替代品用以防控细菌性疾病。

天然中草药具有毒性较弱、药物残留量低、不易产生抗药性等优点，能克服抗生素等化学药物的多种弊端[11]。中草药兼具药用与营养价值，不仅能直接抑杀病原菌微生物[12,13]，还能提高机体的抗应激能力和免疫功能[14,15]，达到防治水产动物细菌性疾病的目的。目前已有较多关于中草药防治水产动物细菌性疾病的报道，但是关于中草药对水产病原非O1/O139 霍乱弧菌的抑菌杀菌作用的研究较少[16]。本实验通过研究23 种具有广谱抗菌活性的中草药提取物对非O1/O139 霍乱弧菌的抑菌作用，以筛选出抑菌作用较好的中草药，并为科学用药防治该菌引起的水产动物疾病提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株非O1/O139 霍乱弧菌GXFL1-4 分离自患病罗氏沼虾，由本实验室保存[2]。

供试中草药有黄芪（Astragalus membranaceus）、石榴皮（Punica granatum）、仙茅（Rhizoma curculiginis）、紫苏（Perilla frutescens Britt）、番泻叶（Folium sennae）、黄柏（Phellodendron chinense）、五倍子（Galla chinensis）、苦地丁（Bunge corydalis Herb）、仙鹤草（Agrimonia pilosa）、地榆（Sanguisorba officinalis）、鹿含草（Herb pyrolae）、大黄（Rheum officinale）、老鹤草（Geraniumwilfordii Maxim）、佩兰（Herba eupatorii）、萹蓄（Polygonum aviculare）、红藤（Sargent gloryvine）、白芍（Paeoniae Radix Alba）、艾叶（Folium artemisiae）、山楂（Crataegus pinnatifida Bunge）、玫瑰花（Flos rosae rugosae）、诃子（Chebula Retz）、板蓝根（Radix isatidis）、木瓜（Chaenomeles sinensis）共23种中草药，购于扬州市同仁堂药房。

1.2 药液的制备

将供试中草药于60℃恒温干燥箱中烘至恒重后各取50 g，放到洗净的砂锅中，各加500 mL 蒸馏水浸泡30 min 后煎煮，煮沸后文火60 min，使用四层纱布过滤药液，收集过滤后药液，剩余药渣加入500 mL 蒸馏水，再次文火煎煮30 min，过滤后收集药液，重复三次，合并滤液后浓缩至生药含量1 g/mL，通过121℃高温湿热灭菌后，置于4℃冰箱保存待用[17]。

1.3 菌悬液的制备

供试菌株接种于3 mL LB 液体培养基，置于28℃恒温摇床中培养16 h，用无菌生理盐水将菌液进行10 倍梯度稀释，通过平板法计数菌落，最终将其稀释至1×107CFU/mL。

1.4 药物体外抑菌试验

采用琼脂打孔法测定中草药水煎剂体外抑菌活性，通过抑菌圈初步筛选出抑菌效果好的中草药。取100 μL 稀释后的菌液（1×107CFU/mL）均匀涂布于直径9 cm 普通琼脂平皿上，待菌液干后，用直径6 mm 的灭菌打孔器在平板上打3 个孔，每孔加入30 μL 中药浓缩液，每种中药设3 个重复。将平板放入4℃冰箱中让药液扩散30 min，再置于28℃恒温生化培养箱中培养24 h，观察并测量抑菌圈直径。

判定标准：用游标卡尺测量孔洞周围抑菌圈直径（包括孔洞直径），每孔取相互垂直方向测量两次，最终求取三孔（6 次）测量结果的平均值，以mm为单位，结果以X±SD 表示。直径≥20 mm 为高度敏感，用“+++”表示；直径15～20 mm 为中度敏感，用“++”表示；直径10～15 mm 为低度敏感，用“+”表示；直径≤10 mm 为不敏感，用“-”表示[18]。

1.5 最小抑菌浓度（MIC）的测定

根据体外抑菌试验结果，选取8 种抑菌作用较好的中草药，采用二倍稀释法测定各药物对非O1/O139 霍乱弧菌的最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）。无菌条件下将中草药提取液加入无菌普通肉汤液体培养基中，使中草药提取液终浓度分别为：500 mg/mL、250 mg/mL、125 mg/mL、62.5 mg/mL、31.25 mg/mL、15.63 mg/mL、7.81 mg/mL 和3.91 mg/mL，然后将100 μL 菌液（1×107CFU/mL）接种到不同药液浓度试管中，同时设置不加药液只加菌液的为阳性对照组，以及只加药液不加菌液的为阴性对照组（中草药提取液终浓度为500 mg/mL），28℃恒温培养24 h，重复测3 次。观察结果，无菌生长试管清澈透明，其最低药物浓度为最小抑菌浓度。

1.6 最小杀菌浓度（MBC）的测定

在MIC 试验基础上，从观察结果为清澈透明无浑浊现象的试管中吸取100 μL 菌液，均匀涂布在固体平板上，于28℃的恒温培养箱培养24 h，以琼脂平板上菌落数不超过5 个的最低药物浓度为该药物对该菌株的最小杀菌浓度（Minimum Bactericidal Concentration，MBC）。

2 结果与分析

2.1 23 种中草药提取液的体外抑菌效果

23 种中草药提取液对非O1/O139 霍乱弧菌的体外抑菌效果见表1。石榴皮、地榆、木瓜三种中草药抑菌圈直径为10～15 mm，为低度敏感；诃子、山楂两种中草药的抑菌圈直径为15～20 mm，为中度敏感；五倍子、白芍、黄柏抑菌圈直径≥20 mm，分别为（19.92±2.12）mm、（19.50±0.74）mm 和（18.92±2.12）mm（图1），为高度敏感；另外15 种中草药抑菌圈直径小于10 mm，为不敏感。本研究的体外抑菌结果表明，选用五倍子、白芍、黄柏为防治非O1/O139 霍乱弧菌的首选抗菌中草药。

表1 23 种中草药的抑菌情况Tab.1 Antibacterial effects of 23 types of Chinese herbal medicines

图1 部分中草药对非O1/O139 霍乱弧菌的体外抑菌效果Fig.1 In vitro antibacterial effects of some Chinese herbal medicines on non-O1/O139 V.cholerae

2.2 最小抑菌浓度

8 种中草药对非O1/O139 霍乱弧菌的最小抑菌浓度（MIC）见表2。五倍子的抑菌作用最好，MIC 为7.8125 mg/mL；白芍的MIC 为15.63 mg/mL，黄柏的MIC 为31.25 mg/mL；石榴皮、地榆、诃子、山楂、木瓜的MIC 最高，均为62.5 mg/mL。

表2 8 种中草药对非O1 霍乱弧菌的最小抑菌浓度（MIC）Tab.2 The minimum inhibitory concentration（MIC）of 8 types of Chinese herbal medicines against non-O1 Vibrio cholerae

2.3 最小杀菌浓度

8 种中草药对非O1/O139 霍乱弧菌的最小杀菌浓度（MBC）见表3，其中五倍子的杀菌作用最强，MBC 仅为7.81 mg/mL；其次为白芍，MBC 为31.25 mg/mL；石榴皮、黄柏、地榆、诃子、山楂、木瓜的MBC 最高，均为125 mg/mL。

表3 8 种中草药对非O1 霍乱弧菌的最小杀菌浓度（MBC）Tab.3 The minimum bactericidal concentration（MBC）of 8 types of Chinese herbal medicines against non-O1 Vibrio cholerae

3 讨论

目前仍主要依靠各种抗生素和各种化学药物防治水产细菌性疾病。这些药物的不科学使用造成了养殖水体污染，水产品种药物残留，威胁人类健康。中草药在水产动物疾病预防和治疗中残留低，不易使病原菌产生耐药性，近年来被广泛用于水产动物细菌性疾病的防治中。张永刚等[19]采用琼脂扩散法和二倍稀释法测定了大菱鲆（Scophthalmus maximus）源哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）对18 种中草药的敏感性，发现五倍子、石榴皮、大黄、乌梅和苏木的抑菌作用最强。任海等[20]在中草药对哈维氏弧菌体外抑菌试验的研究中发现，五倍子、诃子和黄柏等中草药抑菌效果较好。王玉娥等[21]在中草药对致病性弧菌体外抑菌试验的研究中发现五倍子、白芍对哈氏弧菌及河流弧菌等弧菌抑制效果较好，其中五倍子抑菌效果最强，可作为防治水产动物弧菌病的首选药物。梁利国等[16]测定了五倍子等18种中草药对霍乱弧菌等4 种病原弧菌的抑制作用，结果发现五倍子等中草药对病原弧菌具有较好的抑菌效果。本研究采用琼脂打孔扩散法和二倍稀释法初步研究了23 种中草药对非O1/O139 霍乱弧菌的体外抑菌和杀菌效果,发现五倍子、白芍、黄柏对非O1/O139 霍乱弧菌的体外抑菌效果较好，其中五倍子抑菌效果最强。

中草药的抑菌作用与其有效成分有关。每种中草药的有效活性成分种类、含量及抑菌活性不同，抑菌效果也不相同。五倍子中含大量的鞣酸，使蛋白质凝固变性，杀菌能力较强，对革兰氏阳性和阴性细菌抑制作用良好[22]。白芍含有多种生物活性，包括解痉作用、抗炎抗溃疡作用、调节免疫功能、扩血管耐缺氧作用、抗菌作用和解毒作用、抗诱变与抗肿瘤作用等，且白芍中含有易挥发性物质，如白芍醇、没食子酸甲酯、苯甲酸和四没食子酰基葡萄糖等均具有很强的抗菌作用[23]。徐晓津等[24]在研究中提到，白芍对溶血弧菌的抑菌效果高度敏感，与本实验结果一致。通过适当调整中草药浓度使其在实际应用中发挥成效，可以更好地实现中药的抑菌作用。黄柏抗菌有效成分为小檗碱，故其药理作用与黄连大部分相似，但含量较黄连低，体外试验对霍乱弧菌有效或有较强的抑制作用[25]。

本研究测定了23 种常用中草药对非O1/O139霍乱弧菌的体外抑菌及杀菌试验，筛选出8 种有抑菌杀菌作用的中草药，其中具有明显抑制成效的中草药有五倍子、白芍，在日常的养殖生产中，应根据其MIC 与MBC 值合理考虑用药量，使得水生动物体内抑菌以及杀菌浓度达到最佳。这为中草药防治由非O1/O139 霍乱弧菌引起的水产动物疾病提供了用药建议和数据参考。