莱氏拟乌贼卵子发生的组织学观察

王峥，刘长琳，陈四清，金广海，翟介明，林铃生，葛建龙

（1.中国水产科学研究院黄海水产研究所农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室，山东 青岛 266071；2.青岛海洋科学与技术国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，山东 青岛 266071；3.辽宁省淡水水产科学研究院，辽宁 辽阳 111000；4.莱州明波水产有限公司，山东 莱州 261418；5.福建省逸源水产科技有限公司，福建 漳州 363402）

莱氏拟乌贼Sepioteuthis lessoniana 隶属软体动物门Mollusca、头足纲Cephalopoda、枪形目Teuthida、枪乌贼科Loliginidae、拟乌贼属Sepioteuthis，广泛分布于红海、西太平洋和印度洋等海域[1]，也是我国东南沿海常见捕捞水产品，年产量约200 t[2]。

阐明卵子发生过程和卵巢发育特征是头足类繁殖生物学的重要研究内容，对保护头足类自然资源、开展人工繁育及自然资源调查等有重要意义。目前关于头足类卵子分期发育特征的研究较多，主要集中在金乌贼Sepia esculenta[3,4]、曼氏无针乌贼Sepiella maindroni[5]、拟目乌贼Sepia lycidas[6]、福氏枪乌贼Loligo forbesi[7]、皮氏枪乌贼Loligo pealei[8]、长蛸Octopus variabils[9]等，但未见关于莱氏拟乌贼卵子发生的研究报道。本研究采用组织学方法观察了莱氏拟乌贼的卵子发生，依据卵母细胞大小、细胞核形态位置及滤泡细胞结构变化，分析了解莱氏拟乌贼卵子发生各个时期的特征，以期丰富头足类繁殖生物学内容，及为莱氏拟乌贼的人工繁育提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

2020 年8 月在福建海域采用底拖网获得体表无破损的野生雌莱氏拟乌贼性样本7 尾，其中未性成熟的2 尾，平均胴长（11.3±4.5）cm，平均体质量为（210±43）g，性成熟的5 尾，平均胴长为（19.2±6.4）cm，平均体质量为（430±76）g。

1.2 石蜡切片样品的制备

将莱氏拟乌贼沿腹部中线剪开，将性腺切割，置于Bouin's 液中固定24 h，然后用70%酒精溶液冲洗样品（间隔12 h），直至酒精溶液接近透明后保存在70%的酒精溶液。按照组织学研究方法[10]，对样品进行脱水、二甲苯透明、石蜡包埋。使用KD-2508 型轮转式切片机连续切片，切片厚度约5 μm。石蜡切片经脱蜡干燥、H.E 染色、中性树胶封片后，置于Nikon 80i 正置显微镜下拍照并记录分析。

2 结果与分析

2.1 卵子发生分期

依照卵子的大小、细胞核的形态分布和滤泡细胞的结构特征变化，将莱氏拟乌贼卵子发生过程分成4 个阶段、9 个时期（表1），即卵原细胞阶段（卵原细胞期）、原生质生长阶段（无滤泡细胞期、单层滤泡细胞期和双层滤泡细胞期）、间质生长阶段（滤泡细胞增生初期、滤泡细胞增生中期和滤泡细胞增生晚期）和营养质生长阶段（卵黄堆积期和成熟期）。

表1 莱氏拟乌贼卵子发生和结构特征Tab.1 Characteristics of morphology and structure of eggs during oogenesis in Indo-Pacific oval squid Sepioteuthis lessoniana

2.1.1 卵原细胞阶段

卵原细胞期 卵原细胞的形状不规则，少数呈圆形或椭圆形，平均直径为10.8～32.4 μm，细胞质较少，细胞核较大。卵原细胞与滤泡细胞两者分界明显，滤泡细胞呈深蓝色，分散分布在卵原细胞周围（图版Ⅰ-1）。

2.1.2 原生质生长阶段

进入原生质生长阶段的卵原细胞，进行第一次减数分裂发育成卵母细胞。此阶段的卵母细胞体积增大，细胞核增大，胞内物质增多。滤泡细胞数量开始增多，包裹卵母细胞。根据滤泡细胞的状态分为无滤泡细胞期、单层滤泡细胞期和双层滤泡细胞期。

无滤泡细胞期 卵母细胞呈圆形或椭圆形，平均直径为65.8～112.7 μm，细胞质染色较深。细胞核呈圆形，平均直径为32～50 μm，核膜边界明显且光滑，核内染色质呈网状分布，卵母细胞周围未见滤泡细胞（图版Ⅰ-2）。

单层滤泡细胞期 卵母细胞体积增大，细胞近圆形，直径约170.5～185.5 μm，细胞核呈椭圆形，直径约65 μm，核膜明显。此期，出现扁平状的小型滤泡细胞，细胞核成深蓝色，随着滤泡细胞数量逐渐增多，单层排列的滤泡细胞包裹住卵母细胞，形成单层滤泡细胞期（图版Ⅰ-3）。

双层滤泡细胞期 卵母细胞体积继续增大，形态不一，大多呈椭圆形，直径在130.6～202.5 μm 之间，细胞核呈圆形，直径约80 μm。此时的卵母细胞外包裹两层滤泡细胞，滤泡细胞与卵母细胞分界明显，内层为椭圆形滤泡细胞，外层为扁平状滤泡细胞，滤泡细胞间分界不明显（图版Ⅰ-4）。

2.1.3 间质生长阶段

进入间质生长阶段的卵母细胞生长迅速，细胞体积继续增大，卵母细胞外的双层滤泡细胞开始向胞内增生形成突起，直至充满整个卵母细胞。根据卵母细胞大小和滤泡细胞向内的折叠程度分成滤泡细胞增生初、中、晚3 个时期。

滤泡细胞增生初期 细胞呈圆形或椭圆形，平均直径约230 μm，细胞核位于中间，呈圆形，直径约95 μm。此期，滤泡细胞开始向内翻折，形成6 至8个指状突起，突起长度不等，变化在15～30 μm 之间（图版Ⅰ-5）。

滤泡细胞增生中期 细胞呈圆形，平均直径约250 μm，细胞核位于中间，呈圆形或椭圆形，直径约100 μm。卵母细胞内的指状突起数量增多，一般为10～13 个，内折程度更明显，最长约80 μm，椭圆形的内层滤泡细胞体积增大，滤泡细胞与细胞质之间出现明显空隙（图版Ⅰ-6）。

滤泡细胞增生晚期 卵母细胞呈椭圆形，卵径约620.5～855.2 μm，细胞核呈圆形，直径约115 μm，细胞核明显偏向细胞一侧。此期的卵母细胞继续增长，胞内的指状突起迅速延展，形成网状的连接状态。指状突起以椭圆形内层滤泡细胞为主，扁平状的外层滤泡细胞消失（图版Ⅰ-7）。

2.1.4 营养质生长阶段

卵母细胞进入营养质生长阶段后，细胞继续增大。当滤泡细胞占据整个细胞后，椭圆形滤泡细胞个体缩小，并逐渐解体，细胞核消失，指状突起间的空隙有卵黄形成。根据滤泡细胞消失和卵黄出现的状态分成卵黄堆积期和成熟期。

卵黄堆积期 细胞呈椭圆形并继续增大，卵径约1 512.5～1 818.9 μm，细胞核消失。胞内的滤泡细胞解体，指状突起界限模糊，突起间空隙逐渐增大，空隙间形成大量卵黄物质（图版Ⅰ-8）。

成熟期 细胞呈椭圆形，细胞个体达到最大，卵径约2 823.6～3 318.5 μm。胞内几乎充满卵黄物质，HE 染色呈橘红色。此时期只有少数尚未解体的指状突起，滤泡细胞染色较深，但不易分辨（图版Ⅰ-9）。

图版Ⅰ 莱氏拟乌贼卵子发生Plate Ⅰ Oogenesis in Indo-Pacific oval squid Sepioteuthis lessoniana

2.2 滤泡细胞的变化

卵母细胞进入原生质生长阶段后，单层滤泡细胞期的卵母细胞周围生成扁平状滤泡细胞，长约9.5 μm（图版Ⅱ-1）；进入双层滤泡细胞期后，内层滤泡细胞呈椭圆形，直径约7.4 μm，外层的扁平滤泡细胞直径约为10 μm，两种滤泡细胞间分界较明显（图版Ⅱ-2）；进入间质生长阶段后，滤泡细胞向内翻折，椭圆形滤泡细胞直径约9.7 μm，扁平滤泡细胞长约7.5 μm（图版Ⅱ-3），此后滤泡细胞继续向内翻折，滤泡细胞个体稍有缩小，椭圆形滤泡细胞直径约8.8 μm，扁平滤泡细胞长约7.3 μm（图版Ⅱ-4）；当指状突起布满卵母细胞后，滤泡细胞大小变化不大，而扁平滤泡细胞消失（图版Ⅱ-5）；进入营养质生长阶段的滤泡细胞已不能区分，大多已解体（图版Ⅱ-6）。

图版Ⅱ 莱氏拟乌贼卵子发生过程中滤泡细胞的变化Plate Ⅱ The change in follicular cells during oogenesis in Indo-Pacific oval squid Sepioteuthis lessoniana

3 讨论

3.1 莱氏拟乌贼卵子发生的特征

不同物种的卵子发生特征不同，卵母细胞发育时期的划分标准也不同。但大多研究依据卵母细胞的个体大小、胞核形态位置、滤泡细胞形态变化等特征划分发育时期。最早的研究将卵巢发育分成卵原细胞期、单层滤泡细胞期、卵黄泡期、卵黄充满期、成熟期和退化期[3]。蒋霞敏等[5]最早将曼氏无针乌贼划分成卵原细胞期、卵母细胞期、成熟期和退化期4 个时期；尹亚南[4]在郝振林研究的基础上将金乌贼卵子发生更加细化，划分为增生期、小生长期、大生长期、成熟期和退化吸收期5 个时期9 个时相。本研究参照以上及罗江等[6]对拟目乌贼卵子发生的研究，依据莱氏拟乌贼卵子发生过程中卵母细胞形态变化、细胞核大小和位置变化、滤泡细胞与卵母细胞的分布变化及卵黄变化等标志特征，将莱氏拟乌贼卵子发生划分为卵原细胞阶段（卵原细胞期）、原生质生长阶段（无滤泡细胞期、单层滤泡细胞期和双层滤泡细胞期）、间质生长阶段（滤泡细胞增生早期、滤泡细胞增生中期和滤泡细胞增生晚期）和营养质生长阶段（卵黄堆积期和成熟期）4 个阶段9 个时期。

莱氏拟乌贼卵子在卵原细胞阶段和原生质生长阶段胞体较小，进入间质生长阶段和营养质生长阶段后细胞急剧增大。莱氏拟乌贼卵母细胞个体增大时期与其它头足类大体一致，如金乌贼[4]、拟目乌贼[6]、曼氏无针乌贼[5]等，主要是滤泡细胞大量增生内折以及卵黄物质的产生等原因导致。但头足类不同种类间达成熟期后卵子的大小也不同，其原因包括个体大小、繁殖周期和产卵策略等。细胞核也有明显增大，持续至滤泡细胞增生中、晚期，细胞核最大直径约110 μm，并随着滤泡细胞内折发生偏移，最终随着滤泡细胞解体而消失，这与拟目乌贼[6]和皮氏枪乌贼[8]一致。莱氏拟乌贼属于分批产卵类型，即亲体在交配后一段时间内可多次产卵，这与卵巢的组织切片结果一致，卵巢内观察到多个发育时期的卵母细胞。

3.2 滤泡细胞的形态变化和功能

滤泡细胞的出现、折叠变化规律是对卵子发生时期划分的重要依据之一。关于滤泡细胞的来源主要有两种解释：（1）由卵巢内的生殖细胞演化形成[11-13]；（2）由卵巢内的基质细胞分化形成[5,14-16]。受取样条件限制，未取到早期卵巢样品，尚不能确定莱氏拟乌贼卵巢内滤泡细胞的来源，但结合多种头足类卵巢滤泡细胞来源的研究[5,6,9,17]，认为其卵巢内滤泡细胞由基质细胞分化形成。卵巢内两种滤泡细胞的大小和状态处于动态变化中，莱氏拟乌贼卵巢内扁平滤泡细胞的形成和消失皆早于椭圆形滤泡细胞一个时期，且扁平滤泡细胞出现明显的先增大后减小，这些与皮氏枪乌贼[8]和拟目乌贼[9]一致。

滤泡细胞在卵子发生过程中具有重要作用：（1）分泌物质可形成卵膜，如曼氏无针乌贼和青鳉Oryzias latipes 的滤泡细胞的分泌物能形成卵子的次级卵膜[5,18,19,20]；（2）合成并分泌营养物质，如曼氏无针乌贼、金乌贼和拟目乌贼的滤泡细胞能合成并分泌卵黄物质颗粒，证明滤泡细胞能分泌营养物质[4-6,21]；（3）促进排卵，如南方鲇Silurus meridionalis 卵巢的滤泡细胞内富含大量微丝，起到促进排卵的功能[15]。莱氏拟乌贼卵巢内滤泡细胞形成的指状突起数量较多。当这些滤泡细胞解体后，卵子

个体急剧增大，大量的卵黄物质开始形成。推测认为，莱氏拟乌贼卵子内的滤泡细胞同样起到合成并分泌营养物质的作用。