抗菌肽对黄鳝生长性能及免疫力的影响

陈从武，裴梦婷，谭凤霞，杨代勤

（1.长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025；2.湖北省黄鳝工程技术研究中心，湖北 荆州 434025；3.荆州职业技术学院，湖北 荆州 434020）

黄鳝（Monopterus albus）又名鳝鱼、无鳞公子、长鱼等，是我国的主要名优淡水鱼之一。黄鳝在我国养殖历史悠久，尤其在华中地区，已经成为某些区域的经济支柱产品[1]。黄鳝体表无鳞片保护，易受病原微生物侵害，且养殖周期短，养殖成鱼体重只是投入苗种时的3～4 倍[2]，提高其免疫力，提升养殖效率对黄鳝养殖业的发展尤为重要。

抗菌肽（antimicrobial peptides,AMPs）是一类广泛存在于生物体内具抗菌活性的小分子多肽，在自然界中发现的抗菌肽已超千余种[3]。有抗菌广谱性、弱免疫原性或无免疫原性、热稳定性等优点被应用于动物养殖中。目前，抗菌肽在草鱼（Ctenopharyngodon idella）[4,5]、大菱鲆（Scophthalmus maximus L.）[6]、花鲈（Lateolabrax maculatus）[7]、凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）[8]、湘云鲫（Trioloid crucian carp）[9]、锦鲤（Cyprinus carpio koi）[10]、罗非鱼（Oreochromis）[11-13]、石斑鱼（Epinephelus）[14,15]和黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）[16]等的应用均表现出良好的促生长效果，可提高机体的抗氧化力和免疫力，但在黄鳝养殖中的应用研究较少。本实验通过研究在饲料中添加不同浓度抗菌肽对黄鳝生长性能和血清中免疫相关酶活性以及攻毒后的免疫抵抗力的影响，旨在为抗菌肽在黄鳝养殖中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

抗菌肽由深圳市圣西马生物技术有限公司提供。试验用鱼由长江大学黄鳝养殖试验基地人工繁育。将体质健壮的体质量为（30±5）g 的黄鳝随机分为5 个试验组，饲养于长2 m×宽2 m 的网箱中，每组3 个重复，每个重复60 尾黄鳝，分别投喂添加0 mg/kg（对照组）、200 mg/kg、400 mg/kg、600 mg/kg和800 mg/kg 抗菌肽复合物的饲料，饲料组成见表1。

表1 试验分组及饵料组成Tab.1 Test groups and composition of diets

试验从2018 年7 月20 日—9 月28 日，为期68 d。试验期间，水温保持在27.5～31.2℃，pH7.0～7.5，溶解氧5.0～8.5 mg/L，氨氮<0.05 mg/L。每天下午18:00 投喂一次，日投饵量为7%～11%。记录摄食量，及时清除残饵。

1.2 测定指标及方法

试验结束后禁食24 h，每组随机取12 尾黄鳝，冰上麻醉后用75%的酒精擦拭黄鳝尾部，用无菌注射器倾斜45°尾静脉采血，合并2 尾鱼血液于1.5 mL 离心管，室温静置后，4℃冷藏过夜，次日4 000 r/min 离心，分离出血清，-80℃保存。试验结束时，测定各组黄鳝的终末体质量，计算下列指标：

增重率（%）=（Wt－W0）×100/W0；

成活率（%）=Nt×100/N0；

饵料系数=F/（Wt－W0）。

式中：W0和Wt为试验开始时和结束时鱼体质量/g；t 为饲养时间/d；N0为初始尾数；Nt为终末尾数；F 为饲料摄入量/g。

总蛋白（total protein TP）和甘油三酯（triglycerides，TG）含量、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）活性，采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行测定。

1.3 攻毒实验

养殖试验结束时，随机取尾体质量相近的黄鳝暂养7 d 后进行攻毒实验，每组设置3 个重复，每个重复40 尾鱼，每尾鱼腹腔注射0.4 mL 嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）液（菌种来自华中农业大学水产试验室，浓度为1×109CFU/mL）。注射后，每2 h 观察一次鱼的游动、死亡情况，统计7 d 内黄鳝死亡数和死亡时间，计算成活率和免疫保护力。

成活率（%）=100×成活数/初始总数；

免疫保护力（%）=100×（对照组死亡率－试验组死亡率）/对照组死亡率。

1.4 数据统计与分析

数据以平均值±标准误（mean±SEM）表示，用SPSS20.0 软件中的单因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan’s 多重比较检验各组的差异，不同的小写字母表示各组间差异显著（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 抗菌肽对黄鳝生长及成活率的影响

饲料中添加抗菌肽能有效促进黄鳝的生长，降低饲料系数，提高成活率。相较于对照组和组I（200 mg/kg），抗菌肽添加量≥400 mg/kg 时：能显著提高黄鳝的相对增重率（P<0.05）和成活率，且随抗菌肽添加量的增加而上升，在添加量为800 mg/kg 时达到最大，增重率比对照组高出33.0%，成活率比对照组高出7.2%；添加抗菌肽能显著降低11.0%～16.2%的饲料系数（P<0.05），且随添加量的增加而降低，但试验组间无显著差异（P>0.05）（表2）。

表2 摄食基础饲料和含抗菌肽饲料的黄鳝的生长性能、饲料系数和成活率Tab.2 Growth performance,feed utilization and survival rate of paddy eel M.albus fed basal diet and AMPs supplemented diets

2.2 抗菌肽对黄鳝血清生化指标的影响

随着饲料中抗菌肽添加量的增加，能提高黄鳝血清中TP 水平，降低TG 含量，提高ALT 活性，但各试验组TG 含量和ALT 活性与对照组无显著性差异（P＞0.05）。抗菌肽添加量为600 mg/kg 和800 mg/kg 时，黄鳝血清中TP 含量显著提高16.1%～16.7%（P<0.05），组II 与组III 和IV 之间无显著差异，与对照组也无显著差异（P >0.05）。抗菌肽添加量600 mg/kg 和800 mg/kg 时，黄鳝血清AKP 活性显著提高32.7%～37.6%（P<0.05），组I 与组II 虽然AKP 活性升高但与对照组无显著性差异（P>0.05）；抗菌肽添加量为600 mg/kg 时黄鳝血清ACP 活性显著提高（P<0.05），比对照组高65.5%；抗菌肽添加量为800 mg/kg 时ACP 活性较添加600 mg/kg 时低，但两组之间无显著性差异（P>0.05）。随着抗菌肽添加量的提高，黄鳝血清SOD、GSH-Px 和CAT 活性呈先升后降趋势。抗菌肽添加浓度为600 mg/kg时三种抗氧化酶的活性均达到最大值，与对照组相比SOD 活性提高25.4%，GSH-Px 活性提高22.1%，CAT 活性提高34.7%。随着抗菌肽添加量增加到800 mg/kg，三种抗氧化酶的活性均有所下降（表3）。

表3 摄食基础饲料和含抗菌肽饲料的黄鳝的血清生化指标Tab.3 Biochemical indicators of paddy M.albus fed basal diet and AMPs supplemented diets

2.3 抗菌肽对活菌攻毒后黄鳝存活率的影响

投喂抗菌肽能提高黄鳝感染嗜水气单胞菌后的存活率及免疫保护力，且随着抗菌肽含量的增加而升高，添加量为600 mg/kg 和800 mg/kg 时，存活率比对照组显著提高71.4%及85.7%（P<0.05）（表4）。

表4 攻毒试验结果Tab.4 Test data of paddy eel M.albus challenged with Aeromonas hydrophila

3 讨论

3.1 抗菌肽对黄鳝生长及成活率的影响

抗菌肽是一种具有抗菌活性的由少量氨基酸残基组成的碱性生物短肽，是水产动物非特异性免疫系统的重要组成部分。由于作用机制不同，抗菌肽相对于传统抗生素具有不产生耐药性的优点而用于水产养殖中。陈冰等[17]研究表明，在凡纳滨对虾饲料中添加适当的家蝇抗菌肽，不仅可以促进对虾的生长，还可以一定程度地增强对虾的免疫活性。董晓庆等[18]发现，在饲料中添加100～400 mg/kg的天蚕素，可以提高建鲤的特定生长率和增重率以，降低饲料系数，但当天蚕素添加量达到600 mg/kg 时，其增重率呈下降趋势，饲料系数显著升高（P<0.05），抑制了建鲤的生长。本试验中，黄鳝饲料中抗菌肽添加浓度为400 mg/kg、600 mg/kg、800 mg/kg 时，黄鳝的生长、成活率显著提高，饲料系数显著降低，这可能是因为抗菌肽提高了肠道菌群多样性和有益菌的比例，降低了条件致病菌的组成比例[19]，提高了黄鳝对营养物质的消化和吸收能力，降低了发病率。作为小分子多肽的抗菌肽也可作为营养物质被机体利用。适量抗菌肽有利于提高黄鳝产量，降低养殖成本。

3.2 抗菌肽对黄鳝非特异性免疫的影响

3.2.1 抗菌肽对黄鳝血清TP、TG、ALT 的影响

血清中的TP 水平是评价机体健康状况的重要指标，对调节血液渗透压和机体抵抗致病性微生物攻击时参与调节免疫。本试验表明，黄鳝摄食添加抗菌肽的饲料能显著提高其血清中的TP 水平（P<0.05），这与陈奕彬[12]和申红等[20]的研究结果相同，说明抗菌肽能够促进机体对蛋白质的利用贮存，提高机体的免疫力。也有研究表明[21,22]，抗菌肽对血清中的TP 水平无影响或降低，这可能与抗菌肽的种类和受试生物种类、性别、年龄等有关。

血清中的TG 是脂肪代谢的重要指标之一，可为机体供能[23]。某些疾病的发生，例如内分泌有关的代谢性疾病、高血脂症等都有可能导致机体血清中TG 水平升高，较高浓度的TG 还会导致机体心脏疾病或动脉粥样硬化等。抗菌肽可以降低猪血清中的TG 水平（P>0.05）[24]。苏恺等[25]研究显示，断奶仔猪摄食添加浓度为0.4%的抗菌肽饲料时，血清中的TG 水平有所降低，但差异不显著（P>0.05）。本试验结果显示，抗菌肽的添加可降低黄鳝血清中TG水平，但没有显著差异（P>0.05），这与苏恺等[25]的研究结果相似，抗菌肽可以降低机体TG 的合成，具体机制和下降水平的影响仍需进一步研究。

ALT 是一种氨基转移酶，通常大量存在于心脏和肝脏中，血清中含量非常少，当心脏或肝脏发病、细胞受损时，就会进入血清中，导致血清中ALT 活性大幅提升。所以，血清中ALT 的活性大小可以用作诊断心脏和肝功能的重要指标。在鱼饲料中添加浓度为0.4%的抗菌肽可降低ALT 的活性[26]；申红等[20]研究表明，抗菌肽可显著降低白痢鸡血清中的转氨酶活性（P<0.05）；抗菌肽对猪ALT 活性不产生任何影响[23]。在本试验中，添加抗菌肽使黄鳝血清ALT 活性增强，但不存在显著差异（P>0.05）。由此可见，饲料中抗菌肽的添加对黄鳝的肝脏、心脏造成的损伤不明显。

3.2.2 抗菌肽对黄鳝血清磷酸酶的影响

ACP 是巨噬细胞内最具代表性的水解酶，直接参与磷代谢，还与部分营养物质的消化吸收有关[28]，也代表吞噬细胞清除异物的能力[27]。陈冰等[17]研究显示，在饲料中添加抗菌肽能提高凡纳滨对虾血清中AKP 的活性；仲明等[29]用蝇蛆虫肽蛋白粉投喂凡纳滨对虾，发现ACP 活力随着蝇蛆虫肽蛋白粉用量的增加而显著增加；曹俊明等[30]和陈乃松等[31]研究发现，使用蝇蛆粉等氮替代鱼粉投喂凡纳滨对虾，对虾血清中的AKP 活性与对照组差异不显著（P>0.05），甚至低于对照组；刘丽波等[32]使用等量的鲜活蝇蛆来替代人工配合饲料行饲养凡纳滨对虾，结果显示试验组的AKP 及ACP 活性与对照组差异不显著（P>0.05）或低于对照组。本试验结果表明，在饲料中添加抗菌肽后黄鳝血清ACP 及AKP 活性显著提高（P<0.05），当添加比例为800 mg/kg 时AKP 活性最大，添加600 mg/kg 时ACP 活性最大，均显著高于对照组（P<0.05）。以上说明，基础饲料中添加适量抗菌肽有助于提高黄鳝免疫酶活性，这与陈冰等[ 17,29 ]的结果一致，而与曹俊明等[30,31]不一致，推测抗菌肽不能提高免疫酶活性的原因可能是与高温干燥有关。而与刘丽波等[31]的结果不一致可能是由于使用等量鲜活蝇蛆来替代人工配合饲料导致凡纳滨对虾摄食的蛋白质总量下降有关。

3.2.3 抗菌肽对黄鳝血清氧化酶的影响

SOD、GSH-Px、CAT 可保护机体免受氧化的损伤。陈冰等[17]研究表明，添加浓度为3 000 mg/kg 的家蝇抗菌肽可提高凡纳滨对虾血清SOD 活性；也有研究表明，在饲料中添加浓度为0.2%的抗菌肽可以提高团头鲂血清SOD 活性[26]；Dong 等[33]对鲤的研究表明，在饲料中添加100 mg/kg 的天蚕素可显著提高血清SOD 活性（P<0.05）、添加浓度在100～400 mg/kg 可显著提高CAT 活性（P<0.05）。本试验中，添加600 mg/kg 抗菌肽时黄鳝血清SOD、GSH-Px、CAT活性最高，显著高于对照组（P<0.05）。与对照组相比，SOD 活性提高了25.4%，GSH-Px 活性提高了22.1%，CAT 活性提高了34.7%。当添加量进一步增加到800 mg/kg 时，各抗氧化酶活性有所下降。本实验与上述研究具有相似结果，说明黄鳝摄食添加抗菌肽复合物的饲料可增加机体的抗氧化能力。

3.3 抗菌肽对活菌攻毒后黄鳝存活率的影响

鱼类自身的免疫力和抗病力可由感染致病菌后的死亡率高低来体现，采用该指标可以直观评价鱼体免疫机制[34]。本研究采用淡水鱼常见病菌嗜水气单胞菌进行攻毒，结果显示，投喂抗菌肽能够提高黄鳝感染嗜水气单胞菌后的存活率，且抗菌肽投喂量为600～800 mg/kg 时最显著（P<0.05）。这与宋理平等[35]研究结果一致。但也有研究表明，抗菌肽添加量并不能随着浓度的增加显著提高罗非鱼的成活率[36]，可能是由于高剂量抗菌肽会破坏机体肠道内菌群平衡，它在杀灭有害菌的同时也破坏了有益菌的生长环境。还有可能是与免疫相关酶类的活性降低有关[19]，具体机制还需要进一步研究。

3.4 结论

饲料中添加适量抗菌肽可加快黄鳝生长、降低饲料系数、提高成活率，对提升黄鳝免疫相关指标和提高病菌感染后的免疫保护力有一定作用。为提高黄鳝的生长性能和抗病力，使黄鳝养殖业高效、绿色、安全、可持续发展，综合本次试验结果，建议在饲料中添加600 mg/kg 抗菌肽。