银腺杨Pag WOX11/12a基因对茎生长发育的影响

文爽爽　王留强　卢孟柱

关键词：PagWOX11/12a；银腺杨；节间伸长；株高；功能分析

中图分类号：S718.46 文献标志码：A 文章编号：1001-1498（2023）01-0039-08

WUSCHEL-related homeobox（WOX）家族是真核生物中Homeobox（HB）转录因子超家族的成员，该家族成员均含有同源异型结构（Homeodomain， HD），且为植物特异性转录因子。拟南芥（Arabidopsis thaliana （L.） Heynh.）WOX家族共有15个成员，这些成员可分成3个分支：现代/WUS型分支（WUS、WOX1-7）、中间型分支（WOX8-9、WOX11-12）和古老型分支（WOX10、WOX13-14）。除WOX7外，现代/WUS型分支的成员中均含有1个特定的WUS-box结构域，该结构域在中间型分支及远古型分支成员中并不完整。

WOX基因家族的成员参与调控了植物体不同的生长发育过程，它们在调节细胞增殖和分化方面发挥着重要功能，同时也参与了植物顶端分生组织和干细胞的维持、侧生器官和花器官的形成、胚胎发育、激素信号转导和逆境响应等过程。拟南芥WUS蛋白可以通过和SHOOT MERISTEMLESS（STM）的相互作用，增强WUS对CLAVATA3（CLV3）基因启动子的结合能力，二者共同调控CLV3的表达，维持干细胞稳态。同时，AtWOX1基因也可以调控CLV3基因的表达，且能通过调节脱羧酶蛋白（Decarboxylase，SAMDC）活性以及多胺的稳态，参与拟南芥分生组织的发育。AtWOX4基因可以促进原形成层的发育，调节植物的侧向生长。毛白杨Pto WOX5a基因可以调控杨树不定根的发育，过表达该基因能够增加转基因杨树不定根的数量。过表达WOX14可以促进拟南芥体内赤霉素的积累，促进花序茎中的维管细胞分化及木质化。过表达毛白杨WOX11/12a基因可以促进形成层的发育，影响杨树木质部分化。

杨树（Populus）是重要的速生造林树种，同时也是木本植物分子生物学研究的模式植物。已有报道指出，WOX11/12基因可以调控植物的根系发育和茎部次生生长，并能参与植物对非生物胁迫的响应，这表明WOX11/12基因在植物生长发育中起着重要作用。为明确WOX11/12基因对杨树其它组织及器官生长发育的作用，本研究以非转基因银腺杨（Populus alba×P.glandulosa，即‘84K）和PagWOX11/12a显性抑制转基因杨树（35S：：Pag WOX11/12a-SRDX）为材料，研究了显性抑制该基因后杨树高生长及茎中细胞长度的变化趋势，揭示了Pag WOX11/12a基因对杨树茎部生长发育的影响，为进一步探讨其作用机制提供参考。

1材料与方法

1.1研究材料

本研究以84K杨和35S：：Pag WOX11/12a-SRDX（DR）转基因杨树为研究材料，35S：：Pag WOX11/12a-SRDX是由编码SRDX肽的核酸序列与Pag WOX11/12a的cDNA融合构建的载体转化84K杨所得到的转基因苗，该载体可以特异性抑制目标基因的表达，该转基因苗由前期研究获得，组培苗保存于中国林业科学研究院林木遗传育种国家重点实验室。上述组培苗在生根培养基中培养，培养基组成为：1/2 MS（Murashige& Skoog Basal Medium w/Vitamins）基础培养基、0.05 mg·L^-13-吲哚丁酸（3-indole butyric acid，IBA）、0.02 mg·L^-1萘乙酸（Naphthylacetic acid，NAA）及5 mg·L^-1琼脂粉（pH=5.8～6.0）。组培苗培养于人工气候室（温度：24±1℃；光周期：16 h/8 h光照，黑暗；相对湿度：50%～60%：光照强度：55～65μmol·m^-2·s^-1）。待生长21 d后，将组培苗转入营养土（土壤：珍珠岩= 3：1）中，并置于温室培养。

本研究中定量试剂盒SYBR PremixExTaq^TMKit及反转录试剂盒PrimeScript^TMRT reagent Kit购自TaKaRa，RNA提取试剂盒（RNAprep pure Plant Kit）购自QIAGEN。

1.2研究方法

1.2.1生物信息学分析 使用在线网站ExPASy（https：//web.expasy.orglprotparaml）分析PagWOX11/12a蛋白的理化性质。利用植物基因组网站（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）获得毛果杨（Populus trichocarpa Torr.＆Gray） WOX基因家族的氨基酸序列。84K杨基因组获取于Figshare database（ https：//doi.org/10.6084/m9.figsh are.12369209），利用本地BLAST获得84K杨中WOX基因家族的蛋白序列。使用MEGA 11软件，根据邻接法（Neighbor-joiningmethod）构建系统发育进化树，节点旁的数字表示基于1000次重复次数的自展值（Bootstrap）。

1.2.2基因组织表达特异性分析 利用RNA提取试剂盒提取生长60 d的84K杨不同组织的总RNA，包括茎部木质部、韧皮部及形成层、成熟叶、1/2株高处茎部、主根和侧根，提取方法参照说明书。分别用Nanodrop8000和1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度及质量。利用反转录试剂盒合成cDNA，反应体系及条件参照说明书。通过在线网站（https：//sg.idtdna.com/Scitools/Applications/RealTimePCR/）设计PagWOX71/72a的定量引物PagWOX11/12a-RT-F和PagWOX11/12a-RT-R（表1）。利用SYBR Premix Ex Taq^TMKit（TaKaRa）定量试剂及实时荧光PCR仪器Light Cycler 480（Roche Applied Science， Penzberg，Germany）进行qRT-PCR分析。选用PagActin作为内参基因，且进行3次生物学重复和3次技术重复，相对表达量根据2-^△△CT方法进行计算。

1.2.3转基因植株表型鉴定 分别选取84K、DR1和DR9各9株长势一致的组培苗移入营养土中，并将其置于温室培养。拍照记录其表型变化，测量植株在培养第7、14、21、28天后的株高及节间数，统计第28天时前9节间的节间长度。上述实验均进行3次生物学重复。

1.2.4茎段解剖结构分析 选取生长28 d的植株第9节间茎段进行解剖结构分析。于第9节间茎段中部取约0.5～1 cm的材料，使用5%琼脂糖包埋后，将其水平放置固定于样品架上，通过震荡切片机（LEICA VT1000）进行纵切，切片厚度设置为40 pm。将切片置于去离子水中等待后续观察。观察茎段解剖结构时使用0.05%甲苯胺蓝O（Toluidine blue O，TBO）进行染色，待染色结束后用去离子水对样品进行冲洗；随后，用OlympusBX51显微镜进行观察并及时拍照，利用ImageJ软件测量照片中髓心及韧皮部细胞的长度。

1.2.5纤维离析 将生长28 d的植株相同节间茎段切成1 cm长度，去除树皮，并将茎段置于离析液（30%过氧化氢：去离子水：冰乙酸=1：4：5）中，样品至少在56℃金属浴中放置72 h；随后用去离子水将样品洗涤3～5次，并浸泡过夜；最后将样品捣碎，使用TBO进行染色并吸取适量混悬液至载玻片中，置于Olympus BX51显微镜下观察、拍照，通过Image J软件测量木质部纤维细胞的长度。

1.2.6数据统计 使用软件IBM SPSS Statistics23对统计的数据进行分析，使用f检验法分析差异显著水平。

2结果与分析

2.1 84K杨WOX基因家族的鉴定及系统发育分析

毛果杨PtWOX基因家族共有18个成员。利用从Phytozome网站获取的Pt WOX基因序列在84K杨基因组数据库中进行BLAST分析，最后在84K杨中鉴定出18个PagWOX基因家族成员。基于PtWOX和PagWOX的蛋白序列，利用邻接法构建了毛果杨和84K杨WOX家族的系统发育进化树（图1）。根据构建好的系统发育进化树，对84K杨PagWOX进行命名。

2.2 Pag WOX11/12a序列分析

对Pag WOX11/12a基因的核酸及蛋白序列进行分析。结果表明：84K杨与毛果杨WOX11/12a基因的核酸序列相似度为96.88%，蛋白序列相似度为95.29%。Pag WOX11/12a基因编码区长度为768 bp，编码的蛋白序列包含255个氨基酸，该蛋白的分子量约为28.18 kDa，等电点为5.30，脂肪系数为67.22，不稳定系数为62.31，蛋白平均亲水性（GRAVY）为-0.461。

2.3 Pag WOX11/12a基因组织表达特异性分析

为探究Pag WOX11/12a基因在84K杨不同组织中的表达情况，分别提取生长60 d的84K杨的木质部、韧皮部及形成层、成熟叶、1/2株高处茎部节间、主根和侧根的总RNA，反转录后对各部位进行qRT-PCR检测。结果表明：PagWOX11/12a基因在各个部位中均有不同程度的表达，在主根、侧根及韧皮部和形成层中表达量较高，在叶片及茎段中也有一定的表达量，在木质部中表达量最低（图2）。

2.4转基因植株表型分析

为了明确Pag WOX11/12a基因对杨树生长发育的影响，分别统计了非转基因84K和DR转基因植株在温室生长7、14、21和28 d后的表型（图3）。通过统计不同株系的株高与节间数发现，DR转基因植株的株高在第7、14、21、28天时均显著小于非转基因84K，而二者的节间数则无明显差异（图3A，F～G）。同时比较了非转基因84K和DR转基因植株在第28天时前9节间的表型（图3B）以及第1～3、4～6、7～9节间的变化（图3 C～E），可见DR转基因植株的节间长度小于对应84K的节间长度。为进一步明确各株系节间长度的变化，测量了第28天时非转基因84K和DR转基因植株前9节间的长度（图3H）。结果表明：从第2节间开始，DR转基因植株的节间长度均显著小于非转基因84K。上述结果表明，显性抑制Pag WOX11/12a基因抑制了杨树节间的伸长。

为进一步明确Pag WOX11/12a基因对杨树茎部生长发育的影响，取生长28 d的非转基因84K和DR转基因植株第9节间茎段，通过纵切切片观察髓心和韧皮部细胞的结构特征，并统计其长度（图4）。结果表明：DR转基因植株的韧皮部细胞及髓心细胞与非转基因84K相比，长度均有不同程度的减小（图4A～C）。DR1和DR9的韧皮部细胞及髓心细胞长度显著小于非转基因84K。与84K相比，DR转基因株系DR1和DR9的韧皮部细胞分别减小了30%与21%，髓心细胞长度分别缩短了25%及15%（图4D、E）。

除了韧皮部及髓心外，木质部也是杨树茎段的重要组成，利用木质部纤维离析对非转基因84K和DR转基因植株的木质部纤维细胞长度进行了分析（图5）。通过对木质部纤维细胞的长度统计（图5D）可知：DR1和DR9的木纤维细胞与非转基因84K相比，分别减小了26%与20%。上述结果表明，DR转基因植株节间缩短是由茎中细胞长度减小导致。

3讨论

杨树是我国重要的速生造林树种，具有繁殖容易、生长快等特性，是生产建筑、造纸工业及生物燃料生产的重要材料。同时其转基因体系相对成熟，也是最早完成全基因组测定的树种，是木本植物进行分子生物学研究的模式树种。研究参与调控杨树生长发育相关基因，对于杨树的分子育种具有重要意义。本研究选取了与分生组织相关的WOX家族基因，以期明确Pag WOX11/12a基因对杨树高生长发育的作用，进而提高木材产量。

已有研究表明，毛果杨PtWOX基因家族共有18个成员，本研究利用84K杨的基因组信息，通过序列比对在84K中找到了18个同源序列，并构建了系统发育进化树（图1）。通过序列分析发现，PagWOX11/12a基因与毛果杨PtWOX11/12a基因序列相似度较高。

Pag WOX11/12a基因的组织表达特异性分析结果（图2）表明，该基因在主根中的表达量最高，在侧根中表达量也相对较高，这表明PagWOX11/12a基因可能影响杨树根系发育。已有研究表明，在杨树中过表达WOX11/12a可以促进植物根系发育。同时该基因在韧皮部及形成层中也有较高的表达量，暗示该基因很有可能参与韧皮部及分生组织发育的调控。

植株的高度通常由节间数量及节间长度决定。本研究对非转基因84K及DR转基因植株进行表型分析（图3），发现在不同时期内，二者的节间数量均无明显差异，而DR转基因植株的株高则显著低于非转基因84K，表明DR转基因植株的节间长度小于非转基因84K。为明确PagWOX11/72a基因对节间长度的影响，观察并统计了在温室生长28d后非转基因84K及DR转基因植株的节间长度（图3B～E，H），结果显示从第2节间开始，DR转基因植株的节间长度均低于非转基因84K，且差异显著。由此可知，PagWOX11/12a基因可以通过改变节间伸长来影响植株高度，节间长度的降低是DR转基因植株矮化的主要原因。为更精准的分析Pag WOX11/12a基因对杨树高生长的影响，对杨树茎段进行了解剖学分析，通过观察对比非转基因84K与DR转基因植株茎段纵切切片（图4），发现DR转基因杨树茎中韧皮部细胞及髓心细胞长度小于非转基因84K，同时纤维离析结果（图5）表明，与非转基因84K相比，DR转基因植株的纤维细胞的长度也显著变短。上述结果进一步说明，DR转基因植株节间长度的降低是由茎中细胞长度缩短所致，PagWOX11/12a基因可以通过影响杨树茎中细胞长度来控制节间伸长，进而改变植株高度。已有研究表明，毛白杨PtoWOX11/12a基因可以影响杨树茎的发育，改变转基因植株株高及地径，过表达毛白杨PtoWOX11/12a基因后可以促进形成层细胞层数的增加，但会抑制木质部的发育，表明Pto WOX11/12a基因可以影响形成层干细胞的活动及木质部的分化；而84K杨PagWOX11/12a基因可以通过调控韧皮部、髓心细胞及木质部纤维细胞的伸长，影响植株的节间长度，说明了WOX11/12a基因对茎生长发育的调控途径。前期已有研究表明，PagWOX11/12a基因可以促进根系生长，增强植物的抗旱性及耐盐性，而本研究指出，该基因也可以调控杨树茎的生长发育，进一步明确了PagWOX11/12a基因对杨树生长发育新的调控途径。

通过了解Pag WOX11/12a基因对节间伸长的调控作用有助于提高木材产量。已有研究表明，茎段节间伸长主要由生长素（Auxin）、赤霉素（Gibberellins，GAs）、油菜素内酯（Brassinosteroids，BRs）和独角金内酯（Strigolactones，SLs）等激素控制。虽然上述激素在茎段节间伸长中发挥的作用不同，但它们的生物合成或信号转导过程均可能影响植株高度。后续可以通过测定激素含量进一步明确PagWOX11/12a基因影响节间伸长的途径。

4结论

株高是林木遗传育种中的重要性状之一，本研究明确了PagWOX11/12a基因可以通过影响节间伸长改变植株高度，通过统计韧皮部细胞、髓心细胞及木质部纤维细胞的长度可以得知，该基因对节间伸长的抑制主要是通过控制茎中细胞长度来实现的，上述结果对揭示PagWOX11/12a基因对杨树的生长调控机制具有重要意义。