抗菌药物药效学非临床研究技术指南

李聪然 杨信怡 王秀坤 胡辛欣 李国庆 游雪甫

摘要：抗菌药物药效学非临床研究属于抗菌药物临床前研究的重要内容，是指研究药物在体外或体内抑制病原菌生长和复制（抑菌）或使病原菌死亡（杀菌）的作用，主要包括抗菌药物对细菌的最低抑菌浓度、最低杀菌浓度、杀菌曲线、抗生素后效应和半数有效剂量等测定。本技术指南对抗菌药物药效学非临床研究的常用术语、研究内容及方法进行论述，旨在为创新抗菌药物，包括化学药物、生物药物和中药的临床前药效学研究提供参考。

关键词：抗菌药物；药效学；技术指南；抑菌活性；杀菌活性

中图分类号：R978.1文献标志码：A

Abstract Preclinical pharmacodynamic study of antibacterial agents is an important part of preclinical evaluation of antibacterial agents. It refers to the study of the effect of drugs on inhibiting the growth and replication （bacteriostasis） or killing （bactericidal action） of pathogenic bacteria in vitro or in vivo， mainly including  determinations of the minimal inhibitory concentration， the minimal bactericidal concentration， the time-killing curve， the post antibiotic effect， and the half effective dose. These technical guidelines summarize the common methods for preclinical pharmacodynamic evaluations of antibacterial agents， in order to provide a reference for the preclinical pharmacodynamic evaluations of new antibacterial agents， including chemical drugs， biological drugs， and traditional Chinese medicine.

Key words    Antibacterial agents；Pharmacodynamics；Technical guidelines；Bacteriostatic activity；Bactericidal activity

抗菌药物是临床最常用药物之一，抗菌药物不直接作用于机体，而是作用于机体内的细菌，机体、细菌和抗生素三者之间相互作用、相互制约，因此抗菌药物药效学非临床研究方法不同于其他药物，有其自身的特点。本技术指南就抗菌药物药效学非临床研究的常用术语、研究内容及相关实验方法进行论述，包括体外药效学研究的最低抑菌浓度、最低杀菌浓度、杀菌曲线、抗生素后效应等，体内药效学研究的全身感染试验和腿部感染试验等，同时基于细菌耐药严峻状况和新药研发考虑，增加了作用机制、耐药预测及耐药机制研究相关内容，以期为创新抗菌药物研发提供参考和助力。

1 概述

1.1 抗菌药物的定义

抗菌药物（antibacterial agents）是指对细菌具有杀菌或抑菌活性的药物，通常包括来源于微生物次级代谢产物的天然抗生素、在天然抗生素结构基础上改造获得的半合成抗生素，以及全合成抗菌药。

1.2 抗菌药物临床前药效学研究

抗菌药物临床前药效学（pharmacodynamics，PD）研究属于抗菌药物临床前研究的重要内容，是指研究药物在体外或体内抑制病原菌生长和复制（抑菌）或使病原菌死亡（杀菌）的作用。药效学研究主要包括抗菌药物对细菌的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）、最低杀菌浓度（minimal bactericidal concentration，MBC）、杀菌曲线（time-killing curves，KCs），抗生素后效应（post antibiotic effect，PAE）和半数有效剂量（50% effective dose，ED50）等测定。

1.3 本技术指南的目的、应用范围

抗菌药物临床前药效学研究的目的包括以下几个方面：①评价药物体外、体内抗菌效果及抗菌特点；②基本揭示抗菌药物作用靶点及作用机制；③反映药物用于人体时可能的抗菌药理效应，为新药临床试验提供重要依据。

本技术指南所涉及的抗菌药物指具有杀菌或抑菌活性，主要供全身或局部应用的抗菌药物。本技术指南适用于创新抗菌药物，包括化学药物、生物药物和中药。

2 体外药效学研究

体外药效学研究中的最低抑菌浓度（MIC）测定、最低杀菌浓度（MBC）测定等有国际比较公认的方法，如美国的CLSI（Clinical and Laboratory Standards Institute）和欧洲的EUCAST（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing）编写的操作规范。本指南体外药效学研究方法主要参考这两个机构的资料以及部分权威专著和文献，并结合实验室研究经验积累编写。

2.1 最低抑菌浓度（MIC）测定

最低抑菌浓度（MIC）指抑制细菌可见生长的某种抗菌药物的最低浓度。最低抑菌浓度测定的受试菌一般应选择近2～3年的临床分离菌，一些收集困难的菌种可考虑5年内的临床分离株。受试菌种应包括临床常见的需氧革兰阳性菌和革兰阴性菌，必要时应包括厌氧菌。受试菌种的总株数视受试药的类别和抗菌谱特点而定，通常测定创新药物时不少于1000株，必要时需根据受试菌的耐药特点（如是否产β-内酰胺酶、是否为甲氧西林耐藥金黄色葡萄球菌等）进行分类测定。可选择同类药物或具有相似抗菌谱的已知药物作为对照药。根据受试药的抗菌作用水平选择适当的受试浓度，通常在0.03～128 μg/mL范围内。药物配制时按实际活性药物计算。

MIC测定方法[1-5]有琼脂稀释法、微量稀释法、试管稀释法等，可根据受试药物及受试菌的种类选择适当的测定方法。试验时应包括广泛使用的质控菌株，如来自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）、英国国家典型培养物保藏中心（National Collection of Type Cultures，NCTC）等机构的质控菌株。质控菌株MIC测定结果应在药敏标准的可接受范围内。结果描述中需包括抗菌药物对各种受试细菌的MIC50、MIC90和MIC范围（MICrange）等，参照表1格式。

2.2 最低杀菌浓度（MBC）测定

在给定条件下培养一定时间（通常为24 h）能杀死大部分接种受试菌（活菌数减少≥99.9%）的最低药物浓度称为最低杀菌浓度（MBC）或最低致死浓度（minimal lethal concentration，MLC）。根据抗菌药物对目标病原菌的MIC测定结果，选择能体现受试药物药效学特点的细菌进行MBC测定。每种细菌应包含敏感及耐药菌株，通常不少于20株。MBC测定方法主要为试管稀释法和微量稀释法等[3，5-6]。结果描述中需包括MBC范围（MBCrange）、MBC50、MBC90、MBC50/MIC50、MBC90/MIC90、MBC/MIC比值分布等重要指标。

2.3 时间杀菌曲线（KCs）测定

KCs是反映抗菌药物对受试菌杀菌速率的一种时-效动态曲线。受试菌一般应覆盖目标适应证的主要病原菌种，每种细菌最好包含质控菌株、敏感菌株、耐药菌株。

将受试菌接种于培养基中， 接种量约为106 CFU/mL。加入适当浓度的药物，终浓度通常为1/2×MIC、1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC、16×MIC，置35℃继续培养，在培养过程中定时取样， 通常在0、2、4、6、8、12和24 h， 取样后适当稀释，涂布琼脂平皿上计活菌落数， 将菌落数取对数值，绘制时间—菌落数对数曲线即KCs。与初始接种量相比，如果药物可导致菌计数log10值降低≥3（相当于杀死99.9%以上的初始接种菌），则可判断药物具有杀菌活性[3，5-6]。

2.4 抗菌活性影响因素

观察体外培养条件对抗菌药物抗菌活性的影响，通常包括培养基的pH、细菌接种量、血清浓度，必要时包括金属离子（钙、镁、钠等）浓度[5，7]。受试菌一般应覆盖目标适应证的主要病原菌种，通常为3～5种，每种20～30株。

（1）不同pH的影响：测定培养基不同pH值，如pH5.0、6.0、7.0、8.0和9.0时，对抗菌药物MIC值的影响。

（2）细菌接种量的影响：测定细菌不同接种量，如细菌接种浓度为103、104、105、106和107 CFU/mL时，对抗菌药物MIC值的影响。

（3）血清蛋白结合的影响： 测定培养基内不同血清浓度，如血清浓度为0%、25%、50%和75%时， 对抗菌药物MIC值的影响。

（4）金属离子的影响：测定培养基内含不同浓度金属离子，如钙离子浓度为0、25、50、75和100 μg/mL时，对抗菌药物MIC值的影响。

2.5 抗生素后效应（PAE）的测定

抗生素后效应（PAE）是指抗菌药物与细菌短暂接触后去除受试药物，在一定时间内细菌生长仍然持续受到抑制的生物效应[8-9]。PAE以时间来衡量，计算公式为PAE=T-C，其中T为给药组细菌与药物作用一定时间后，去除受试药物，菌落数增加十倍（log10值增加1）所需要的时间，C为对照组菌落数增加十倍（log10值增加1）所需要的时间。

根据抗菌药物MIC和MBC结果选择受试菌株，应覆盖目标适应证的主要菌种。每种细菌应包含敏感菌株、耐药菌株，以及同种细菌的质控菌株。药物浓度通常为1/4×MIC、1/2×MIC、1×MIC、2×MIC和4×MIC。药物作用时间视药物作用特点而定，可从几分钟到几小时不等。去除受试药物的方式包括反复洗涤、稀释、过滤和使药物失活等，其中最常用的方法为稀释，需要注意稀释后应确保残余药物量不会对细菌生长产生影响。通常1×MIC浓度100倍稀释即可，更高的药物浓度则需要1000倍、10000倍稀释。PAE结果描述中通常需包括PAE曲线图，以及PAE值等。

2.6 作用机制研究

抗菌药物作用机制是抗菌药物临床前药效学研究的重要组成，应在条件允许情况下尽可能开展作用机制研究。对于已知結构类型的抗菌药物，可从结构类似物的已有抗菌机制入手进行研究，如β-内酰胺类抗生素，可以研究其对细胞壁的影响、对β-内酰胺酶的稳定性等。对于全新结构类型的抗菌药物，或者作用机制存在疑问的抗菌药物，可以通过诱导耐药突变株筛选、全基因组测序、突变株突变位点/耐药机制验证等来反推抗菌药物的可能作用机制，再通过分子生物学、酶学、表型等多种方法进行作用机制验证[5，10-12]。

2.7 耐药预测与耐药机制研究

在抗菌新药研发过程中，应关注新药的耐药发展情况及可能的耐药机制，为新药上市和临床应用提供重要依据。耐药预测与耐药机制研究[10-14]通常包括：

（1）耐药频率测定：取适当浓度菌液（通常为109 ～1010 CFU/mL），100～200 μL/平皿涂布于含不同浓度受试药物（通常2×MIC～64×MIC）的琼脂平皿中，培养一定时间（通常为24或48 h）后，记录耐药突变菌落数，耐药突变菌落数与接种活菌落数的比值即为耐药频率。

（2）耐药突变株筛选及耐药机制分析：将一定量菌液涂布于含不同浓度受试药物的琼脂平皿中，每天观察平皿中突变菌落生长情况，并对突变菌落进行鉴定、耐药水平测定、全基因组测序、耐药突变位点分析验证、耐药突变株适应性代价测定等，为药物可能的耐药情况提供前瞻性预测，并为药物可能的作用机制提供思路。

（3）连续传代对药物MIC值的影响：通常用肉汤法观察连续传代对药物MIC值的影响。方法为将菌株接种于含亚抑制浓度（如1/4×MIC）受试药物的肉汤中，每天用新鲜含药培养基稀释传代（通常为1：1000稀释，传代2～4周）。保存传代菌液，测定其对药物的MIC值，观察随着传代次数的增多，药物MIC值变化的趋势。

3 体内药效学研究

抗菌药物体内药效学研究分为全身感染试验和局部感染试验，后者又包括腿部感染、呼吸系统感染和泌尿系统感染等试验。本部分内容主要依据比较权威的专著、文献，并结合实验室研究经验积累编写。

3.1 全身感染试验

全身感染试验常用菌液经腹腔或尾静脉注射引发感染，其中小鼠腹膜炎模型是抗菌药物研究中的第一个实验动物模型，也是抗菌药物体内药效学研究中的常规实验模型[5，8，15-16]。

（1）动物：选择外观健康的封闭群（如昆明种或ICR）小鼠，体重18～22 g。必要时可选用大鼠、豚鼠等其他动物。

（2）药物：配制时按实际活性药物折算含量，对于不稳定的药物，要现配现用。药物剂量的选择可参照药物的体外MIC结果和已知对照药的体内疗效剂量，并经预试验确定。原则上药物给药途径应与拟推荐的临床给药途径一致。

（3）感染细菌：根据药物的抗菌作用特点和体外MIC结果选择不同的菌种和菌株。广谱抗菌药物应包括革兰阳性菌和革兰阴性菌各1～2种。创新药物应包括革兰阳性菌和革兰阴性菌各2种以上，每种细菌至少2株，并应包括临床分离致病菌。选择能使感染动物全部死亡的最小菌量即最小致死量（minimal lethal dose，MLD）作为感染菌量。小鼠感染途径通常为腹腔注射、尾静脉注射。尾静脉注射通常用生理盐水菌悬液，而腹腔注射需用含5%干酵母或5%胃膜素（mucin）的菌悬液。

（4）试验过程：将小鼠按体重随机分组，每个药物设4～6个剂量组，另设感染对照组，必要时增设溶媒或赋形剂对照组，每组至少10只，雌雄各半。小鼠腹腔注射（0.5 mL/鼠）或尾静脉注射（0.2 mL/鼠）100%最小致死量（100% MLD）的菌液引发感染。首次给药通常为感染后1 h，给药频率及次数根据药物PK/PD特点而定。给药后观察动物的活动和反应情况，必要时检查体温、体重、局部反应及血液学指标，记录动物死亡时间和数量，通常观察感染7～14 d内动物死亡数，计算半数有效剂量（ED50）及其95%可信限，進行统计学分析，并与对照药进行比较。资料整理可参照表2～3。

3.2 局部感染试验

评价创新抗感染药物的体内抗菌活性，仅用全身感染试验不能满足新药评价要求，需要有与临床感染近似的局部感染试验。本部分列出了常用的腿部感染、呼吸系统感染、泌尿系统感染试验的研究方法。局部感染试验除了上述3种类型外，还有骨髓内感染、心内膜感染、眼角膜感染、蛛网膜下感染、副睾丸感染、肌肉感染、皮内感染、皮下感染等，可参考上述3种类型研究方法进行。

3.2.1 腿部感染试验

腿部感染[5，8，15， 17-18]一般用小鼠或大鼠经腿部肌肉注射菌液引发感染，感染菌通常选用金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌等。

（1）感染动物：常用小鼠或大鼠，通常选用环磷酰胺构建免疫抑制状态动物。

（2）药物：配制时按实际活性药物折算含量，药物剂量可参照药物的体外MIC结果及已知对照药的体内疗效剂量，并经预试验确定。原则上药物给药途径应与拟推荐的临床给药途径一致。

（3）感染细菌：根据菌株致病力，将新鲜培养菌液配制为所需浓度的生理盐水菌悬液作为感染菌液，小鼠腿部肌肉注射菌液引发感染。

（4）试验过程：以小鼠为例，实验前小鼠腹腔注射环磷酰胺致免疫抑制状态。小鼠按体重随机分组，每个药物设3～5个剂量组，同时设感染对照组，必要时增设溶媒或赋形剂对照组。每组至少10只动物，雌雄各半。小鼠腿部注射部位消毒后，肌肉注射50～100 ?L的感染菌液进行感染。一般感染后2 h开始给药，给药次数、间隔时间根据药物PK/PD特点及疗效而定。末次给药后18 h处死动物，取腿部肌肉，组织匀浆菌计数法检查腿部活菌数量，并进行统计学分析。

3.2.2 呼吸系统感染试验

呼吸系统感染[5，8，15，19-20]（肺部感染）的常用感染方法有滴鼻法、支气管插管法和感染箱法。疗效判断指标一般包括肺部组织菌计数、动物生存数、肺部炎症变化、细菌学和组织病理学检查等。感染菌通常选用肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌等。

（1）感染动物：常用小鼠，亦可选用大鼠、豚鼠等其他动物。必要时可选用环磷酰胺构建免疫抑制状态动物。

（2）药物：配制时按实际活性药物折算含量，药物剂量可参照药物的体外MIC结果和已知对照药的体内疗效剂量，并经预试验确定。原则上药物给药途径应与拟推荐的临床给药途径一致。

（3）感染细菌：根据菌株致病力，将新鲜培养菌液配制为所需浓度的生理盐水菌悬液作为感染菌液，小鼠经滴鼻、支气管插管等方式感染，体积一般为20～50 ?L/鼠。

（4）试验过程：以小鼠为例，将小鼠按体重随机分组，每个药物设3～5个剂量组，同时设感染对照组等，每组至少10只动物，雌雄各半，动物麻醉后用选定方法感染。首次给药时间一般为感染后4～12 h，给药次数根据药物PK/PD特点及疗效而定。末次给药后18 h，处死小鼠，取出肺，组织匀浆菌计数法检查肺活菌数量，并进行统计学分析。若需做肺部组织病理学检查，观察肺感染后损伤程度，可适当增加每组动物数。

3.2.3 泌尿系统感染试验

泌尿系统感染[5，15，21-22]常采用上行性肾感染模型，常用方法有膀胱注射菌液上行性肾感染和泌尿道插管注入菌液上行性肾感染两种。感染菌通常选用大肠埃希菌，也可选用肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等。

（1）感染动物：常用雌性小鼠或大鼠，感染前16～24 h和感染后4～6 h禁水。

（2）药物：配制时按实际活性药物折算含量，药物剂量可参照药物的体外MIC结果和已知对照药的体内疗效剂量，并经预试验确定。原则上药物给药途径应与拟推荐的临床给药途径一致。

（3）感染细菌：根据菌株致病力，将新鲜培养菌液配制为所需浓度的生理盐水菌悬液作为感染菌液，小鼠感染体积一般为10～50 ?L/鼠。

（4）试验过程：以小鼠为例，将小鼠按体重随机分组，每个药物设3～5个剂量组，同时设感染对照组等，每组至少10只动物，动物麻醉后用选定方法感染。首次给药时间一般为感染后4～6 h，给药次数根据药物PK/PD特点及疗效而定。末次给药后18 h处死小鼠，取出双侧肾脏，用肾组织匀浆菌计数法或肾剖面盖印法检查肾脏活菌数量，并进行统计学分析。若需做肾脏组织病理学检查，观察肾脏感染后损伤程度，可适当增加每组动物数。局部感染资料整理可参考表4。

参 考 文 献

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作者简介：李聪然，女，生于1979年，研究员，主要研究方向为抗菌药物的发现、评价及机制研究，E-mail： congranli@imb.pumc.edu.cn