新疆小麦籽粒SOD活性及 TaSOD-A1位点等位变异的分布

孙 玲,程宇坤,刘 鹏,马丽荣,王继庆,耿洪伟

(1. 新疆农业大学农学院/优质专用麦类作物工程技术研究中心,新疆乌鲁木齐 830052; 2. 新疆农业大学作物遗传改良与种质创新重点实验室, 新疆乌鲁木齐 830052; 3. 德州市农业科学研究院,山东德州 253015)

小麦是中国重要的粮食作物[1],品质改良是其主要的育种目标之一[2]。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)与面粉色泽、面团流变学特性、面制品营养品质有关,是影响面制品最终加工品质的重要因素[3-5]。

研究表明,SOD活性是由多基因控制的数量性状,受环境影响较大,但主要由遗传因素决定[6-8]。研究发现,不同小麦材料籽粒的SOD活性不同,适当低温可使SOD活性升高,其中在4 ℃时最高,在2 ℃时最低[9];小麦叶片的SOD活性随着盐浓度的升高而降低,这可能是由于活性氧含量的增加破坏了抗氧化防御系统的功能[10];低浓度PEG-6000胁迫处理时,黑麦草叶片的SOD活性升高,随着浓度的升高,SOD活性逐渐下降[11]。Wu等[12]和Beak等[13]将控制小麦籽粒Mn-SOD(含锰超氧化物歧化酶)活性相关基因定位到2A、2B和2D染色体长臂,将控制小麦籽粒Cu/Zn-SOD(含铜锌超氧化物歧化酶)活性基因定位到7A、7B和7D染色体长臂;王继庆等[8]利用国内外冬小麦为材料,结合90K SNP芯片进行全基因组关联分析(Genome-Wide Association Analysis, GWAS),在5A染色体上检测到控制小麦籽粒SOD活性贡献率最高的位点(基因ID为TraesCS5A01G290800,本研究将其命名为TaSOD-A1),且该位点在3个环境下均能检测到;赵永亮等[14]在2D染色体Xfbb377～Xfbcd410的区段也发现了一个影响SOD活性的位点。

目前对小麦籽粒中过氧化物酶(peroxidase,POD)、脂肪氧化酶(lipoxygenase,LOX)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)等抗氧化酶及其与小麦品质性状的相关性研究已较为深入,并开发了相应的功能标记[15-17],但对小麦籽粒中SOD活性及其相关基因等位变异的研究还未见有报道。本研究在测定117份新疆小麦品种(系)籽粒SOD活性的基础上,结合功能标记SODA1和SODA11对小麦5A染色体上TaSOD-A1基因的等位变异进行检测,分析等位变异与SOD活性的相关性,以期利用分子标记辅助选择育种技术培育高SOD活性的小麦新品种。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验材料共计117份,包括24份新疆春小麦品种(系)和93份新疆冬小麦品种(系)。其中,24份新疆春小麦品种(系)包括2000年以来的近期自育品种(系)20份,2000年之前的早期自育品种(系)4份;93份新疆冬小麦品种(系)包括17份地方品种、35份引进品种(系)和41份自育品种(系)。这些材料来自新疆不同区域,代表新疆小麦不同时期的状况,由新疆农业大学农学院小麦遗传育种课题组提供。新疆春小麦分别在2017、2018、2019年,冬小麦分别在2016-2017、2017-2018、2018-2019连续3个年度种植于新疆农业科学院玛纳斯实验站,随机区组设计,行长2 m,行距0.25 m,株距0.1 m,每个品种(系)种植3行,2个重复。田间管理与当地保持一致,小麦长势良好,正常收获,为避免品种混杂,人工脱粒。

1.2 SOD活性检测

SOD活性测定按照王继庆等[8]的方法。将小麦籽粒去杂后,称取10 g过0.8 mm旋风磨,取0.1 g全麦粉置于2 mL离心管中,加入1 mL SOD提取介质并振荡混匀,在摇床上冰浴2 h后,10 000 r·min-1摇培15 min,取上清液(SOD粗酶液)4℃保存。SOD活性测定选用氮蓝四唑(NBT)光化还原法,反应总体系为300 μL,包括0.05 mol·L-1的磷酸缓冲液150 μL,灭菌水20 μL,130 mmol·L-1的甲硫氨酸(Met)溶液30 μL,750 μmol·L-1的氮蓝四唑(NBT)溶液30 μL,100 μmol·L-1的EDTA-Na230 μL以及20 μmol·L-1的核黄素溶液30 μL,最后加入10 μL粗酶液,室温条件下于560 nm波长处测定吸光度。每个品种的SOD活性重复测两次,若两次结果相差超过10%,则需重复测定。SOD活性以抑制NBT光还原的50%为一个酶活性单位表示,单位为U·g-1。

1.3 DNA提取及质量鉴定

用SDS法[3]提取DNA,并用紫外分光光度计和电泳检测DNA的纯度。紫外分光光度计检测时,OD260/OD280的比值是衡量核酸纯度的标准之一,比值在1.7～2.0之间表明DNA纯度较好,低于1.7表明含有其他杂质,高于2.0表明DNA已经降解。电泳检测时,取5 μL DNA和1 μL 6×Loading Buffer进行琼脂糖凝胶电泳检测,以条带单一不拖带为宜。

1.4 TaSOD-A1位点等位变异检测

利用本课题组前期开发的功能标记SODA1和SODA11检测小麦5A染色体上TaSOD-A1位点的等位变异,引物信息见表1,由上海生工生物有限公司合成。以小麦基因组DNA为模板,在Eppendorf PCR仪(Eppendorf,德国)上进行PCR分析。SODA1标记在含有TaSOD-A1a等位变异的材料中可以扩增出1 419 bp的片段,而在含有TaSOD-A1b等位变异的材料中无扩增片段;SODA11标记在含有TaSOD-A1b等位变异的材料中可以扩增出2 567 bp的片段,而在含有TaSOD-A1a等位变异的材料中无扩增片段。SODA1和SODA11标记的PCR反应体系均为25 μL,包括模板DNA(100 ng·μL-1) 1 μL,上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL,2×Taq Master Mix(with dye)(诺唯赞,南京) 12.5 μL,无菌水补足至25 μL。SODA1标记的PCR反应程序:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,63.7 ℃退火30 s,72 ℃延伸1.5 min,35个循环;72 ℃ 8 min;4 ℃保存。SODA11标记的PCR反应程序:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,61 ℃退火30 s,72 ℃延伸2.5 min,35个循环;72 ℃ 8 min;4 ℃保存。将PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后,进行凝胶成像分析。

表1 检测 TaSOD-A1位点等位变异的引物信息

1.5 数据处理

用Excel 2010及IBM SPSS statistics 25.0进行数据统计分析、独立样本T检验,根据方差方程的Levene检验判断两组数据方差是否相等,然后查看对应的T值及显著性水平。

2 结果与分析

2.1 不同类型新疆小麦籽粒的SOD活性

117份新疆小麦品种(系)在3个环境下的籽粒SOD活性平均值分别为1 607.65、 1 593.85和1 589.07 U·g-1,变化范围分别为1 351.54～1 808.71、1 329.59～1 762.22、1 340.93～1 782.29 U·g-1,3个环境下的SOD活性相关系数在0.73～0.79之间,呈显著相关,所有材料取3个环境下SOD活性的平均值作为最终SOD活性值。117份新疆小麦品种(系)的籽粒SOD活性在1 360.38 ～ 1 741.04 U·g-1之间,平均值为1 596.86 U·g-1,其中冬小麦平均值 (1 607.30 U·g-1)高于春小麦平均值(1 556.39 U·g-1)。新疆春小麦近期品种(系)的籽粒SOD活性平均值(1 561.20 U·g-1)高于早期品种(系)的籽粒SOD活性平均值(1 549.10 U·g-1);冬小麦地方品种(系)的籽粒SOD活性平均值最高(1 640.44 U·g-1),引进品种(系)的籽粒SOD活性平均值次之(1 620.93 U·g-1),自育品种(系)的籽粒SOD活性平均值最低(1 581.93 U·g-1),但均无显著差异(表2)。

表2 不同类型新疆小麦品种(系)的籽粒SOD活性

2.2 TaSOD-A1位点等位变异类型的检测结果及其与SOD活性的关系

利用前期开发的TaSOD-A1位点功能标记SODA1和SODA11,对117份新疆小麦品种(系)进行等位变异检测,结果(图1)显示,24份新疆春小麦品种(系)中,3份材料用SODA1标记可扩增出1 419 bp的片段,说明这些材料含有TaSOD-A1a;21份材料用SODA11标记可扩增出2 567 bp的片段,说明这些材料含有TaSOD-A1b。93份新疆冬小麦品种(系)中,56份材料用SODA1标记可扩增出1 419 bp的片段,说明这些材料含有TaSOD-A1a;37份材料用SODA11标记可扩增出2 567 bp的片段,说明这些材料含有TaSOD-A1b。

A:SODA1标记的扩增结果;B:SODA11标记的扩增结果。M1:DL2000;M2:DL5000;1:新春22;2:新春34;3:新春30;4:新冬7号;5:新冬21号;6:新春03;7:新春40;8:新春26;9:新春27;10:新春31。

进一步分析含有TaSOD-A1位点不同等位变异新疆小麦品种(系)的籽粒SOD活性,发现TaSOD-A1a等位变异类型材料的籽粒SOD活性在1 514.48～1 741.04 U·g-1之间,TaSOD-A1b等位变异材料的籽粒SOD活性在 1 360.38～1 715.53 U·g-1之间,且TaSOD-A1a等位变异材料的籽粒SOD活性平均值(1 628.71 U·g-1)显著高于含有TaSOD-A1b等位变异材料的平均值(1 564.46 U·g-1),说明TaSOD-A1a是改善面制品色泽和营养品质的优异等位变异类型。在新疆冬小麦的引进品种(系)中,TaSOD-A1a等位变异材料的SOD活性平均值(1 634.59 U·g-1)显著高于TaSOD-A1b等位变异材料的平均值(1 584.78 U·g-1)(表3),进一步证明了SODA1和SODA11标记的准确性较高,可辅助选育高SOD活性的小麦品种。

表3 含有TaSOD-A1位点不同等位变异的新疆小麦品种(系)的籽粒SOD活性

2.3 新疆冬小麦和春小麦 TaSOD-A1位点的不同等位变异分布

从表3可以看出,117份新疆小麦品种(系)中,59份材料含有TaSOD-A1a等位变异,占比50.4%;58份材料含有TaSOD-A1b等位变异,占比49.6%。24份新疆春小麦品种(系)中,3份材料含有TaSOD-A1a等位变异,占比12.5%,21份材料含有TaSOD-A1b等位变异,占比87.5%;93份新疆冬小麦品种(系)中,56份材料含有TaSOD-A1a等位变异,占比60.2%,37份材料含有TaSOD-A1b等位变异,占比39.8%。新疆24份春小麦全部为自育品种(系);新疆冬小麦品种(系)中,TaSOD-A1a等位变异的分布频率高低依次为引进品种(系)(30.1%)>自育品种(系)(19.4%)>地方品种(10.8%);TaSOD-A1b等位变异的分布频率高低依次为自育品种(系)(24.7%)>地方品种(7.5%)=引进品种(系)(7.5%)。

3 讨 论

3.1 新疆小麦品种(系)的SOD活性

目前SOD活性检测有邻苯三酚自氧化法、氮蓝四唑(NBT)光还原法、黄嘌呤氧化酶-NBT等方法[18-21],其中NBT光还原法的灵敏度较高[22]。本研究用此方法检测新疆小麦品种(系)的籽粒SOD活性,发现3个环境下籽粒SOD活性的变化幅度最大值为457.20 U·g-1,且3个环境间的SOD活性显著相关,相关系数在0.73～0.79之间,表明NBT光还原法检测小麦籽粒SOD活性的准确性和稳定性较高。检测结果表明,新疆小麦品种(系)的籽粒SOD活性平均值(1 596.86 U·g-1)低于中国四个麦区主要种植品种的籽粒SOD活性平均值(北部冬麦区1 801.74 U·g-1,西南冬麦区1 787.21 U·g-1,黄淮冬麦区1 771.19 U·g-1,长江中下游冬麦区 1 759.67 U·g-1)[8],原因可能是新疆属于干旱地区,年降水量较少,同时还会遭遇高温等逆境胁迫,最终导致小麦品种(系)籽粒SOD活性的升高,但这一结果也印证了环境会影响SOD活性。新疆冬小麦籽粒SOD活性平均值(1 607.30 U·g-1)明显高于新疆春小麦籽粒SOD活性平均值(1 556.39 U·g-1),说明新疆冬小麦品种(系)可用于高SOD活性小麦的改良。在新疆冬小麦品种(系)中,地方品种和引进品种(系)的籽粒SOD活性相等,且较高,因此地方品种是新疆小麦品质改良的主要着力点,育种工作要积极推广地方品种,同时加大引进外地品种的力度,才能加快新疆小麦品质改良的进程。

3.2 TaSOD-A1位点功能标记的实用性验证

功能标记因操作简单和高效,广泛应用于作物育种中。小麦籽粒SOD活性影响面制品的加工品质和营养品质[4-5],培育高SOD活性的小麦新品种具有重要意义。本研究用TaSOD-A1位点的功能标记SODA1和SODA11对新疆小麦品种(系)进行等位变异检测,发现TaSOD-A1位点的等位变异与SOD活性显著相关,其中含有TaSOD-A1a等位变异材料的籽粒SOD活性平均值(1 628.71 U·g-1)显著高于含有TaSOD-A1b等位变异的材料(1 564.45 U·g-1)。但同时也存在个别等位变异类型与预测SOD活性高低不相符的情况,且含有TaSOD-A1a等位变异材料的籽粒SOD活性也并非总是高于含有TaSOD-A1b等位变异材料的籽粒SOD活性。其原因可能是小麦基因组中除TaSOD-A1位点外,还存在其他与籽粒SOD活性相关的基因/QTL。王继庆等[8]研究表明,SOD活性为数量性状,由多基因控制,在多个染色体上均含有微效基因,不同基因的互作效应以及同一基因不同位点的差异都是导致SOD活性差异的原因。后续将开发5B、5D等其他染色体上的功能标记,通过不同标记的组合更有效地筛选高SOD活性的品种,为小麦SOD活性改良提供参考。

3.3 新疆小麦品种(系) TaSOD-A1位点等位变异的分布规律

93份新疆冬小麦品种(系)中,含有与高SOD活性相关的TaSOD-A1a等位变异材料占比为60.2%,其中引进品种(系)占比最高,地方品种占比最低,说明引进品种(系)是优异等位变异的主要力量,新疆早期的育种工作主要围绕地方品种展开,外地品种(系)的引入在很大程度上提高了优异等位变异的数量;24份新疆春小麦品种(系)中,只有3份近期品种(系)为优异等位变异类型,占比12.5%,说明新疆地区早期对小麦籽粒SOD的关注度较低,对籽粒SOD活性与小麦品质的相关性研究较晚。作物的产量与品质之间存在一定的负相关[23],为解决温饱问题,中国主要注重小麦的产量,而对小麦品质的改良直到20世纪后期才受到关注,这可能会导致品质较好的小麦品种被淘汰。在今后的新疆小麦育种工作中,应把注意力放在来自国内外的优良外引品种(系)上,才能加快小麦的品质改良进程。

4 结 论

新疆冬小麦品种(系)的籽粒SOD活性平均值明显高于新疆春小麦品种(系)。功能标记SODA1和SODA11可以较好地区分TaSOD-A1位点的等位变异TaSOD-A1a和TaSOD-A1b,进而预测SOD活性的高低,外引品种(系)是新疆小麦SOD活性改良的主要力量。