油菜素内酯对低温胁迫下冬小麦 wcor413-like基因表达的影响

王璐瑶,丁美云,孙玉婷,张东向,2,李珊珊,2,金忠民,2,兰红宇,刘丽杰,2

(1.齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,黑龙江齐齐哈尔 161006; 2.黑龙江省抗性基因工程与寒地生物多样性保护重点实验室,黑龙江齐齐哈尔 161006; 3.黑龙江省农业科学院齐齐哈尔分院,黑龙江齐齐哈尔 161006)

低温是限制植物生长的主要环境因素之一,东农冬麦1号是首例可以在黑龙江省高寒地区过冬的超强冬性小麦品种[1],可以抵御-30 ℃的低温。此外,东农冬麦1号能够提高黑龙江省可耕土地的复种指数,可与大豆等作物套种,不仅可实现“两年三熟”,增加土地资源利用率,而且解决了大豆的重茬问题,这对我国粮食增产具有重要的意义。

wcor413-like基因属于COR(cold-regulation)基因家族[2]。COR基因是一类在低温诱导下可快速表达的植物抗寒基因,也称为低温诱导( low temperature induced,LTI)基因[3]。研究发现,小麦在抵御严寒时,COR基因编码的蛋白可保护细胞的结构[3-6]。COR基因启动子区含有C-重复元件/脱水响应元件(C-repeat/dehydration responsive element, CRT/DRE)[4],在低温胁迫下,细胞膜发生相变,改变了细胞膜的流动性,细胞内肌动蛋白骨架进行重排,Ca2+离子通道开启,使得Ca2+离子浓度升高,诱导COR基因的表达[7]。CRT/DRE顺式作用元件的调控途径:顺式作用元件CRT/DRE与转录活性因子CBF(C-repeat binding factor)结合,促进COR基因的表达,进而提高植物的抗寒性[8-9]。因此,研究低温胁迫下wcor413-like基因的表达模式,为了解植物的抗寒机制奠定了基础。

油菜素内酯 (brassinosteroid,BR) 作为一种类固醇激素,可调控作物细胞的伸长、分裂和分化[10-12],增强作物的抗逆性[13-16],进而有利于提高作物的产量[17]。BR在植物体内的含量极低,但其生理活性极高,极低浓度的BR处理就可以对植物产生明显的影响[18-20]。研究表明,在低温胁迫下,BR可以减轻低温对辣椒[20]、番茄[21]等植物的伤害。目前,关于BR对冬小麦抗寒基因表达的影响尚未见报道。本研究对寒地冬小麦东农冬麦1号中的wcor413-like基因进行克隆,利用生物信息学对wcor413-like基因cDNA序列进行分析,利用qRT-PCR技术分析不同温度(5 ℃、0 ℃、-10 ℃和-25 ℃)处理下,BR对冬小麦叶片和分蘖节中wcor413-like基因表达量的影响,探索wcor413-like调控冬小麦的抗寒机制,以期为研究冬小麦在高寒地区安全越冬提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及处理

试验材料为寒地冬小麦品种东农冬麦1号(TriticumaestivumL.),由齐齐哈尔大学生命科学与农林学院植物代谢生理实验室提供。供试材料于2020年9月播种于齐齐哈尔大学试验田中,株距5 cm,行长1.6 m,行距20 cm,常规田间管理。于小麦三叶期时,在叶片表面喷施浓度为0.1 mg·L-1的BR溶液,对照组喷洒蒸馏水,在此期间实时监测室外温度,连续10 d最低温度平均值分别为5 ℃、0 ℃、 -10 ℃和-25 ℃时,对冬小麦叶片和分蘖节进行取样。所取样品用蒸馏水进行冲洗,擦干后用锡纸包裹后放入液氮中进行速冻,并放于-80 ℃冰箱进行冷冻保存。

1.2 RNA的提取及cDNA的合成

分别取0.1 g叶片和分蘖节,用Trizol法提取RNA,用微量紫外分光光度计检测RNA的浓度后,于-80 ℃冰箱保存备用。利用反转录试剂盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit(TaKaRa,大连)合成cDNA第一条链。

1.3 wcor413-like基因的克隆

在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中获得小麦wcor413-like基因的全长序列(GenBank登录号:AY057118.1),用Primer 5设计特异性引物wcor413-like-F/R(表1),按照试剂盒Premix TaqTM(TaKaRa,大连)说明书的PCR反应体系进行PCR扩增,PCR反应程序: 94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,65.5 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min 20 s,30个循环;72 ℃ 10 min。用胶回收试剂盒(景新生物,杭州)将目的条带进行回收,并连接到pMD18-T Vector(TaKaRa,大连)载体上,连接产物导入大肠杆菌(Escherichiacoli)感受态细胞DH5α中,挑取阳性单克隆摇培12 h,随后进行菌液PCR检测,利用质粒提取试剂盒(索莱宝,北京)进行质粒提取,将提取的质粒送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序。

1.4 wcor413-like蛋白的生物信息学分析

利用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)对wcor413-like蛋白的理化性质进行分析。利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr)预测蛋白质的二级结构;利用Swiss-model(https://swissmodel.expasy.org/)预测wcor413-like蛋白的三级结构。利用MEGA 5.0构建小麦与其他10种植物wcor413-like蛋白的系统进化树,利用MEME-Submission(https://meme-suite.org/meme/tools/meme)对这些物种的蛋白序列进行比对。利用IncLocator在线数据库(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/lncLocator/)对蛋白进行亚细胞定位。

1.5 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析

根据wcor413-like基因的cDNA序列设计qRT-PCR引物wcor413-like-2F/2R(表1),以TaActin为内参基因,按照TB Green Premix Ex TaqTM试剂盒(TaKaRa,大连)说明书的PCR反应体系对基因进行qRT-PCR分析。PCR反应程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,共40个循环。用2-ΔΔCt法进行计算基因的表达量,用SPSS软件进行差异显著性分析。所有的处理均进行3次生物学重复。

表1 本研究用到的引物信息

2 结果与分析

2.1 wcor413-like基因的克隆结果及其序列分析

分别以冬小麦东农冬麦1号分蘖节和叶片的cDNA为模板进行PCR扩增,均可扩增出629 bp的条带(图1)。将目的片段的预测结果提交到NCBI数据库(Gene ID:2571178),分析表明,wcor413-like基因的开放阅读框区为629 bp,可编码209个氨基酸。

M:DL2000;1:H2O;2:分蘖节;3:叶片。

2.2 wcor413-like蛋白的生物信息学分析

2.2.1 wcor413-like蛋白的理化性质分析

ProtParam分析结果表明,wcor413-like蛋白的分子式为C1044H1628N274O268S11,相对分子质量为22 658.75 Da,属于稳定蛋白质,稳定指数为 44.44,理论等电点(pI)为9.21。wcor413-like蛋白的氨基酸组成中,亮氨酸的含量最高,占比15.8%,表面带负电荷的氨基酸(天冬氨酸+谷氨酸)残基有11个,表面带正电荷的氨基酸(精氨酸+赖氨酸)残基有17个,平均亲水系数为0.589(表2)。

表2 冬小麦wcor413-like蛋白的氨基酸组成

2.2.2 蛋白二、三级结构预测

利用SOPMA对wcor413-like蛋白进行二级结构预测,结果(图2A)显示, wcor413-like蛋白含有102个α-螺旋(H),占比49.4 %;13个β-转角(T),占比6.25 %;46个延伸片段(E),占比22.12%;47个无规则卷曲(C),占比22.6%。 利用Swiss-model对wcor413-like蛋白的三级结构进行预测,结果(图2B)显示,该蛋白的三级结构与二级结构一致。

图2 wcor413-like蛋白的二级结构(A)和三级结构(B)

2.2.3 wcor413-like蛋白的系统进化树分析以及同源蛋白序列比对

利用MEGA 5.0构建小麦与二粒小麦(Triticumdicoccoides)、大麦(Hordeumvulgare)、柳枝稷(Panicumvirgatum)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、玉米(Zeamays)、毒麦(Loliumtemulentum)、粟米(Setariaitalica)、割手密(Saccharumspontaneum)、高粱(Sorghumbicolor)以及模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)wcor413-like蛋白的系统发育树,结果(图3)显示,小麦与大麦、二粒小麦的wcor413-like蛋白亲缘关系最近,而与玉米和高粱wcor413-like蛋白的亲缘关系较远。利用Clustal软件对上述植物wcor413-like蛋白的基序进行比对,结果(图4)显示,除拟南芥和玉米含有一个相同的基序外,小麦与其他8种植物(二粒小麦、大麦、柳枝稷、二穗短柄草、毒麦、粟米、割手密、高粱)均含有三个相同的基序。

图3 小麦与其他10种植物wcor413-like蛋白的系统发育树

图4 不同物种的wcor413-like蛋白质motif分析

2.2.4 wcor413-like蛋白的亚细胞定位预测结果

利用IncLocator在线工具对wcor413-like蛋白进行亚细胞定位预测,结果(表3)显示,wcor413-like蛋白在细胞质中占比最大,为 32.69%;其次为核糖体和细胞溶质,分别占比 21.26%和16.99%;在外泌体和细胞核中占比较小,分别为19.11%和9.95%。

表3 wcor413-like蛋白亚细胞定位预测结果

2.3 低温胁迫下BR处理对冬小麦叶片和分蘖节中 wcor413-like基因表达模式的影响

从表4可以看出,随着温度的降低,冬小麦叶片中wcor413-like基因的表达量在对照组中呈先升后降的变化趋势,在-10 ℃达到峰值,显著高于5 ℃和-25 ℃的表达量;在BR处理组中呈先降后升的变化趋势,在-25 ℃达到峰值,显著高于5 ℃、0 ℃和-10 ℃的表达量。分蘖节中wcor413-like基因的表达量在对照组中呈先降后升的变化趋势,在BR处理组中呈“升-降-升”的变化趋势,均在-25 ℃达到峰值,且均显著高于5 ℃、0 ℃和-10 ℃的表达量。与对照组相比,BR处理提高了冬小麦叶片中wcor413-like基因在5 ℃、-10 ℃和-25 ℃的表达量;降低了冬小麦分蘖节中wcor413-like基因在5 ℃、0 ℃、 -10 ℃和-25 ℃的表达量,均在-25 ℃达到显著水平。

表4 低温胁迫下BR处理对冬小麦叶片和分蘖节中 wcor413-like基因相对表达量的影响

3 讨 论

低温不仅影响作物的品质和产量,而且会造成严重的农业灾害,因此研究低温对农业生产的影响至关重要。研究表明,COR基因家族成员在低温条件下能够快速表达,且在叶片中表达量较高[22]。wcor413-like基因作为COR基因家族的成员之一,推测其参与植物的抗寒过程。

在植物非生物胁迫的过程中,BR具有正向调节的作用。外源喷施一定浓度的BR可阻止植物幼苗产生过多的自由基,从而维持细胞膜结构和功能的稳定性,增加植物对逆境的适应能力[23]。研究表明,BR可以提高水稻[24]、玉米[25]、小麦[26]、香蕉[27]等植物的抗寒能力。本研究初步探讨了不同低温条件下BR处理对冬小麦东农冬麦1号叶片和分蘖节中wcor413-like基因的表达模式,发现随着温度的降低,对照组叶片中该基因的表达量呈先升后降的变化趋势,在-10 ℃时达到峰值;而分蘖节中该基因的表达量呈先降后升的变化趋势,在-25 ℃时达到峰值。这与崔 红等[28]对冬小麦分蘖节中wcor413-like基因的分析结果相吻合。推测wcor413-like基因参与冬小麦抗寒过程。经过BR处理后的东农冬麦1号,wcor413-like基因在叶片中的表达量呈先降后升的变化趋势,在分蘖节中的表达量呈“升-降-升”的变化趋势,均在-25 ℃达到峰值。此外,-25 ℃时,BR处理后叶片中wcor413-like基因的表达量约为对照组的49倍,而分蘖节中的表达量约为对照组的一半,两个处理间wcor413-like基因的表达量差异均达显著水平。初步预测冬小麦wcor413-like基因在-25 ℃才开始对寒冷做出应答反应,且BR处理可促进该基因在叶片中的表达。

4 结 论

本研究从寒地冬小麦东农冬麦1号中克隆到wcor413-like基因,开放阅读框为629 bp,可编码209个氨基酸,其编码的蛋白属于稳定蛋白质,分子量为22 932.43 Da,主要分布于细胞质中。-25 ℃时分蘖节wcor413-like基因的表达量明显高于叶片中的表达量。BR处理叶片中wcor413-like的表达量显著高于对照组,而分蘖节中wcor413-like的表达量显著低于对照组。本研究初步分析了wcor413-like基因在冬小麦抗寒过程中发挥的功能,为BR参与低温调控提供了信息支持,也为探索wcor413-like基因调控冬小麦的抗寒机制提供理论依据。