卵黄抗体替代抗生素在抗水生致病菌感染中的应用

陈弘立 赵 轩 徐冰洋 秦艺铭 林晨韬＊

（1.福州海洋研究院/海洋生物优良种质创制与工程化繁育技术研发中心 福州 350117；2.福建师范大学南方海洋研究院/福建省微藻种质改良工程技术研究中心 福州 350117；3.福建师范大学生命科学学院/福建省特色海洋生物资源可持续利用重点实验室 福州 350117）

福建省是海洋大省，2022 年预计全省海洋生产总值1.2 万亿元，海洋经济规模继续保持全国前列。全省水产品总量862.4 万t， 其中海水养殖产量548.9 万t，居全国第一。 大黄鱼、南美白对虾、牡蛎、鲍鱼、鳗鲡、紫菜等六大优势品种全产业链产值均超100 亿元。 但随着水产养殖业的快速发展，高密度集约化程度增大，病害频发，抗生素等药物滥用情况严重，导致部分水产品中药物残留超标，不仅威胁到食品安全，也影响水产品的出口，给福建省水产养殖业造成了巨大的经济损失。

当前我国养殖业中病害防治仍以抗生素为主，抗生素在预防及治疗水生动物细菌性疾病方面发挥着不可替代的重要作用，据统计我国超过70%的抗生素都用在养殖业上。 但抗生素滥用易引发病原耐药和药物残留问题，继而危害消费者健康。 2006 年起， 欧盟禁止将抗生素用于促进动物生长。 在党中央、国务院关于养殖业绿色发展的总体要求下，我国于2018 年4 月制定了《兽用抗菌药使用减量化行动试点工作方案（2018-2021）》，并明确了养殖端减抗和限抗的时间表。在农业农村部政策要求下，药物饲料添加剂已经在2020 年8 月全部退出。抗生素的禁用与抗感染形势的严峻性使得水产养殖中的抗生素替代已经迫在眉睫。 当前开发出了溶菌酶、抗菌肽、益生菌、发酵产物、中草药、有机金属微量元素等抗生素替代品， 其中卵黄抗体作为一种绿色高效的抗生素替代品得到了人们的青睐[1]。

卵黄抗体（egg yolk immunoglobulin，IgY）是一种主要存在于禽类、 两栖动物以及爬行动物中的免疫球蛋白， 与哺乳动物免疫球蛋白IgG 有功能和遗传学相似性，发挥了类似的免疫学功能[2]。 目前研究最多的是鸡的卵黄抗体，通过抗原刺激蛋鸡，产生的特异性抗体富集到蛋黄中， 提取的卵黄抗体可以通过浸泡、注射和饲喂进行被动免疫，因具有不产生耐药性、制备简单、产量大、稳定性好、符合动物福利要求、不激活哺乳动物的补体系统等优势[3]，越来越受到人们的关注。 本文从卵黄抗体适合于饲料添加的特性出发探讨其替代抗生素的可能性， 并概述其在抵抗不同的水生致病菌感染中的应用研究， 为卵黄抗体作为抗生素替代物的研究及在水产养殖中的应用提供参考。

1 卵黄抗体的特性决定其适合于饲料添加

1.1 卵黄抗体的产生及特异性 爬行动物、两栖动物、 鸟类中的主要血清抗体IgY 在遗传学上被认为是哺乳动物中IgE 及IgG 的进化前体， 有相当高的保守性，功能上实质性发挥着IgG 的作用。哺乳动物转移IgG 到胎盘中，而IgY 与之类似，特异性抗体能通过血清转移到蛋黄中提供免疫保护[4]。 禽类特有的法氏囊壁上的B 淋巴细胞受到外源抗原的刺激后，分化为浆细胞分泌特异性抗体，经过循环系统转运结合到卵黄膜上，形成卵黄抗体[5]。 由于进化上禽类与哺乳动物及鱼类亲缘关系较远， 卵黄抗体往往不易发生交叉反应，而且具有更好的特异性。卵黄抗体通过被动免疫抵抗病原菌感染，效果显著，已作为抗生素替代品广泛运用于畜禽疾病的防治[6]。

1.2 卵黄抗体的稳定性 IgY 有两条轻链（L）和重链（H），分别为25 kD 和70 kD 左右。 其中每条轻链和重链都有1 个可变区（VL 或VH），轻链有1 个恒定区（CL）而重链有4 个恒定区（CH），其中轻链和重链通过二硫键进行连接[2]。 与IgG 相比，IgY 的重链没有铰链区域的存在， 这恰恰增加了它结构上的稳定性。IgY 具有较好的耐热、耐酸和耐酶解能力。IgY在4 ℃下可贮存6～7 年，在室温下可保持6 个月，而65 ℃时也可保持24 h 以上，在70 ℃时加热90 min后其活性才明显下降。 IgY 在弱酸及弱碱性（4＜pH＜10）时比较稳定，抗菌活性较高。 IgY 对胃蛋白酶有较高的抵抗力，能抵抗幼龄动物的胃酸屏障。有研究表明，通过添加糖类物质如甘露糖、葡萄糖会改善热稳定性， 添加岩藻糖或者山梨醇能增强卵黄抗体在胃部环境时的酸稳定性[7-8]。 因此，卵黄抗体的稳定性使其适合在饲料生产过程中添加[4]。

1.3 产量高及分离纯化便捷 在蛋鸡免疫后，IgY会被输送到蛋中，收集鸡蛋就可方便获得卵黄抗体，相比采集兔等动物血清要方便得多， 而且更加符合动物福利要求，避免规模养殖后生物伦理问题。在合适条件下蛋鸡每天能产一枚鸡蛋， 约15 mL 的卵黄，其中卵黄抗体数量可观，卵黄抗体的产量高也使得其作为饲料添加的成本相对较低[9]。

卵黄抗体是卵黄中水溶性γ 活性蛋白，从卵黄中获得卵黄抗体包括分离和提取， 其中分离的原理是去除卵黄中的脂肪以及脂蛋白，获得水溶性组分，提取工艺是通过水稀释法、 三氯甲烷萃取法和聚乙二醇法分离蛋黄中脂肪、脂蛋白，单独获得其中的水溶性γ 活性蛋白[10-11]。 获得的水溶性蛋白通过水稀释法和硫酸铵沉淀法[12]将其与其他水溶性组分分离开， 再使用蛋白纯化方法获得较为纯净均一的卵黄抗体。当然，卵黄本身也可以作为营养物质直接在饲料中添加[6]。

2 卵黄抗体在预防和治疗水生致病菌感染中的应用

2.1 弧菌属 弧菌属常见于淡水和海洋中，作为革兰氏阴性杆菌，喜好温暖的咸水，具有季节性暴发的特点[13]。 而在水产养殖中出现的哈维氏弧菌合并鳗弧菌感染在全球海洋渔业弧菌病中较为常见， 提示迫切需要一种抗生素替代品来解决[14-15]。

蛋鸡注射两种弧菌属菌种产生的特异性卵黄抗体能特异性抵抗这两种菌。Gao X J 等[16]同时注射被福尔马林灭活的哈维氏弧菌和副溶血弧菌， 使蛋鸡产生的抗弧菌（哈维氏弧菌和副溶血弧菌）卵黄抗体IgY 并加入白虾幼苗中， 经过特异性抗弧菌蛋黄粉激活，用哈维氏弧菌和副溶血弧菌攻毒，平均死亡率分别为38.2%、41.6%， 显著低于用对照蛋黄粉的85.6%和86%。

在特异性卵黄抗体中加入免疫佐剂， 能显著性增加卵黄抗体的特异性免疫能力。Kumaran T 等[17]注射抗哈维氏弧菌IgY 抗体V.h wo 和添加不同佐剂的特异性IgY 抗体V.h A 及V.h G，可将印度白虾的存活率分别提高到63%、88%、89%， 空白对照全部死亡，非特异性IgY 对照组的存活率只有44%，具有显著性差异。 饲喂抗哈维氏弧菌IgY 抗体V.h wo 30 d 后攻毒， 印度白虾死亡率达30%的时间为15 d， 而饲喂非特异IgY 印度白虾在7 d 的死亡率为100%。喂食抗哈维氏弧菌V.h wo、V.h A 和V.h G膳食60 d 的累计死亡率分别为50%、30%和15%，显著优于非特异性IgY 的100%死亡率。

无脊椎动物（海参）、节肢动物（虾）、软体动物（鲍鱼）和脊椎动物（鱼）等常见水生养殖动物都能使用卵黄抗体进行被动免疫， 以降低水生致病弧菌带来的危害和经济损失。 Li X 等[18]对海参注射和浸泡浓度梯度（1、5、10 mg/mL）溶藻弧菌特异性IgY 的存活率分别为45%、60%、80%， 显示出浓度相关的特异性抗菌能力，而非特异性IgY 组的存活率为35%，空白对照为20%，有显著差异性。 Gao X 等[19]发现，半滑舌鳎分别饲喂含抗鳗弧菌蛋黄粉、 普通蛋黄粉和基础膳食的死亡率分别为30%、86.7%、93.3%。Arasteh N 等[20]研究发现，虹鳟鱼在1、3、7、14 d 感染鳗弧菌后腹腔注射抗鳗弧菌IgY 抗体的死亡率在30%以下， 非特异性抗体和PBS 对照组的死亡率在80%左右。Wu C J 等[21]研究发现，小鲍鱼在溶藻弧菌注射攻毒前1 周饲喂含5%、10%抗溶藻弧菌IgY，14 d 后存活率约为70%，而非特异性IgY 对照组在2 d 内全部死亡。

2.2 气单胞菌属 气单胞菌作为革兰氏阴性菌，一般存在于各种水环境中（地表水、地下水、氯化饮用水），在自然环境和水产养殖的鱼类、爬行类、两栖类中分离到蛙气单胞菌及嗜水气单胞菌等[22]。 Jin L等[23]试验中银鲫浸泡特异性IgY 抗体后，使用嗜水气单胞菌注射攻毒，死亡率为30%，而非特异性IgY抗体组及空白对照组的死亡率都是80%。

有时在宿主尚未感染致病菌前， 预防性注射特异性卵黄抗体相较于感染后治疗具有更好的抑菌效果和存活比率。Li X L 等[24]研究发现，银鲫对嗜水气单胞菌感染中，注射特异性IgY（s-IgY）和在攻毒前(预防)存活率为60%，攻毒后（治疗）为30%，非特异性IgY（n-IgY）和PBS 对照组预防和治疗的存活率为0。 银鲫肾脏中的平均细菌数量，特异性IgY 组相较于非特异性IgY 和对照组在预防中降低了3 个数量级，而在治疗嗜水气单胞菌感染（攻毒后）中降低了2 个数量级， 更好的抑菌性使得特异性IgY 在早期细菌预防中发挥效果相对于治疗有显著性差异。卵黄抗体不仅可以通过注射，采用浸泡、饲喂的方式也可以能够起到较好的被动免疫的保护效果。 邹栋良等[25]发现黑龙江银鲫腹腔注射嗜水气单胞菌特异性IgY（4 mg/尾），与对照组相比可降低累计死亡率50%左右。饲料添加5%特异性IgY 的被动保护效果最佳，累计死亡率在50%左右，浸泡400 mg/mL 特异性IgY 预防效果最好，累计死亡率30%，对照组全部死亡。 Gan H 等[26]将锦鲤浸泡中浓度（0.2 g/L）和高浓度（0.5 g/L）特异性抗杀鲑气单胞菌卵黄粉后，死亡率分别为50%和70%，而非特异性卵黄粉和空白对照组累计死亡率均高于90%。Qin Z D 等[27]研究发现，钝吻鲷感染前（预防）注射5 mg 抗嗜水气单胞菌IgY 和在感染后12 h（治疗）注射5 mg 抗嗜水气单胞菌IgY 的存活率分别为60%和50%，相较于非特异性IgY 和对照组的存活率（10%和0）有显著性差异。

2.3 爱德华氏菌属 爱德华氏菌在淡水和海水中广泛分布，迟缓爱德华氏菌、杀鱼爱德华氏菌、安圭拉爱德华氏菌、伊氏爱德华氏菌等都从鱼体中发现，如日本比目鱼、欧洲鳗鱼、大菱、斑点叉尾鮰等[28]。Gutierrez M A 等[29]研究显示，口服给药日本鳗鲡抗迟缓爱德华氏菌IgY（400 mg/尾），在104-6CFU 剂量的迟缓爱德华氏菌感染下有100%的存活率，在107CFU 剂量下仍有60%的存活率，远高于缺少IgY抗体保护、感染剂量104-7CFU 的最高存活率25%。Xu L 等[30]发现，口服含有5%、3%和1%微囊化特异性抗迟缓爱德华氏菌IgY 饲料的大菱鲆存活率分别为63.3%、56.7%和20%， 相比于阳性对照组和非特异性IgY 组中大菱鲆第10 d 的存活率为0， 具有显著差异性。

3 结 语

卵黄抗体由于不易产生耐药性、制备简单、产量大、稳定性好、符合动物福利要求等优势，有望成为水产养殖中安全有效的抗生素替代品。 但由于水产养殖环境的复杂性， 卵黄抗体在实际生产中的应用还有一些问题需要解决。 腹腔注射往往能有更高的存活率， 但在养殖生产上侵入性地对每尾鱼进行注射不仅带来很高的人工成本，还可能引起创口感染。口服饲料通过食道进入胃部， 可能是更好的免疫方式。人们也在研究增加卵黄抗体稳定性的方法，如添加NaHCO3作为抗酸剂， 脱氧胆酸钠作为黏液溶解剂和膜增溶剂，提高卵黄抗体吸收效率，降低途经胃部时变性水解的几率[31]。浸泡也是有效的保护方式，但对于卵黄抗体的纯度要求会更高。目前，卵黄抗体的成本还是会高于传统的广谱的抗生素产品。 卵黄抗体规模化生产与工厂化蛋鸡的鸡蛋生产具有一定的环节共通性， 但是后续对鸡蛋组分中卵黄抗体提取工艺的自动化和工厂化可能还需要进一步研究和开发。 在环境保护的需求下随着研 究的深入，卵黄抗体在水产养殖中的应用会越来越广泛。