聚乙二醇修饰技术的应用研究进展

贾友彪,于凤波,张雯慧,高俊霞,王 强

(牡丹江医学院,黑龙江 牡丹江 157011)

聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG),经环氧乙烷聚合而成,是一种由重复的氧乙烯基组成的直链或具有支链的高分子化合物。PEG有2个末端羟基,具有线性的(相对分子量5 000～30 000)或支化的(相对分子量40 000～60 000)链状结构。研究表明,PEG具有良好的水溶性,也可以溶于二氯甲烷、乙醇等多种有机溶剂,无毒,无免疫原性与抗原性,无致炎性,是一种生理惰性、安全的药物辅料,同时具备抑菌性,是液体制剂的理性辅料,所以被美国FDA批准可作为体内注射药用聚合物。PEG及其衍生物具有众多的优良性质:无毒,免疫原性低,具有较好的生物相容性,并且由于PEG具有很多种不同分子量的分子,在化学、材料等方面的应用也十分广泛[1]。

1 聚乙二醇的修饰

PEG修饰即PEG化(PEGylation),就是将高分子量的聚乙二醇聚合物通过共价键接入到另一个分子上,从而制备出在体内具备长循环功能的活性物质或是递药系统。PEG修饰的这一概念最初是由Davis和Abuchowski在1970年提出的,当时的PEG修饰主要集中在蛋白质化学修饰方面。他们以三聚氰胺为偶联剂使甲氧基聚乙二醇与牛血清白蛋白共价连接,并发现改性后的牛血清白蛋白水溶性增加,不会与天然牛血清白蛋白的抗体发生反应被消除。与未改性的蛋白相比,改性后的牛血清白蛋白在溶解度、丙烯酰胺凝胶电泳迁移率、离子交换色谱和沉降等性能方面发生了显著变化。

经过几十年的发展后,PEG修饰技术逐渐成熟并应用于医药领域,活性物质或递药系统经PEG修饰后[2],(1)分子量会增加,降低药物的肾脏清除率,有效延长药物半衰期,增强药物稳定性;(2)形成高分子隔断层,阻断血浆对纳米制剂的吸附,可减少体内代谢酶对药物的发现与降解;(3)溶解性提高;(4)毒性降低;(5)作用部位的血药浓度波动减小,最大血药浓度降低。

2 PEG修饰技术研究进展

2.1 PEG修饰技术在蛋白质、多肽类药物中的应用蛋白质和多肽类药物特异性高、安全性高、疗效明确,但是在人体内易被酶发现降解,血浆中半衰期较短,因而致使很多药物无法在临床应用[3]。蛋白质和多肽类药物通过PEG修饰后,可以改变其生物化学特性,减少药物的肾脏清除率,保护其不被酶发现,增加其稳定性,延长半衰期,同时还可降低免疫原性和抗原性。

蛋白质、多肽的PEG化通常是指将活化后的PEG与蛋白质分子中的氨基、羧基或巯基进行偶联,下面根据不同修饰位点分别介绍PEG的修饰方法。

2.1.1 氨基修饰 氨基修饰是最常用的PEG修饰方法,因为氨基具有较高的亲核反应活性,且暴露在分子表面,易与PEG修饰剂发生化学反应。早期PEG修饰主要针对N-末端的α-NH2和赖氨酸的ε-NH2,应用较为广泛的有PEG-琥珀酰亚胺碳酸酯(PEG-SC)、PEG-醛(PEG aldehyde)、PEG-琥珀酰亚胺琥珀酸酯(PEG-SS)等,此类修饰剂所需的反应条件较为温和,对药物的稳定性影响不大[4]。但是,PEG化氨基修饰的缺点也十分明显,反应选择性低,产物同分异构体数量多,难以分离纯化得到单一的PEG化产物。随着PEG修饰技术的发展,研究者们研究开发出多种方法来改良上述问题,比如改变反应条件,Shan-shan Ma[5]等人通过控制pH使用PEG修饰重组人白细胞介素-11突变蛋白(mIL-11),对赖氨酸残基进行定点修饰,得到的PEG-mIL-11生物学活性未发生改变,改善了药代动力学和药效学等性质,最大血浆浓度增加了26倍以上,单剂量给药作用持续时间与每天给药7～10次的mIL-11一致。

2.1.2 羧基修饰 羧基是一种蛋白质侧链上常见的化学反应基团,在二环己基碳二亚胺(DCCI)或1-乙基3-二甲氨基丙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)存在下,将PEG分子中的羧基转化为氨基,再与蛋白质中的羧基发生缩合反应。N6,是一种从钩虫中分离的芳烃-3衍生物,本身具有较强的抗菌活性,但是对酶水解并且体内抗性较差,难以在临床治疗中应用[6]。Ting Li[7]等人使用PEG修饰N6的C-末端得到N6-COOH-miniPEG,与N6相比,修饰后的产物在胰蛋白酶中的稳定性更高;根据荧光分析,在0.75～2 h后,N6主要集中在腹腔处,而N6-COOH-miniPEG遍布全身各处,体内生物分布更加广泛;在脂多糖(LPS)刺激的RAW264.7细胞中,N6-COOH-miniPEG可使白细胞介素-10(IL-10)水平升高(37.83%),高于N6(-10.21%)。

2.1.3 巯基修饰 巯基具有较高的亲核活性,在蛋白质、多肽分子中的含量极少,所以产物单一,容易分离纯化。但是有游离巯基的蛋白质、多肽数量很少。因此,研究者们通过基因工程技术将巯基引入蛋白质、多肽的特异性位点,再用对巯基呈现一定活性的PEG进行定点修饰,常用的能与巯基特异性反应的PEG偶联试剂主要有PEG-马来酰亚胺(PEG-MAL)、PEG-邻-吡啶二硫醚(mPEG-OPSS)、PEG-乙烯基砜(mPEG-VS)等。江辛琳[8]等人使用mPEG-MAL对β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)的第121位游离羧基进行修饰并筛选了实验条件,得到产物β-LG-PEG,研究证明修饰后的蛋白结构发生部分去折叠,β折叠含量约降低7%,无规则卷曲含量约升高6%,内源荧光强度有所增强,抗原性显著提升。

2.2 PEG修饰技术在小分子有机药物中的应用近年来,研究者们发现很多小分子药物也可以用聚乙二醇进行修饰,在大多数情况下,PEG与小分子药物“不稳定结合”,在特定条件下水解释放游离药物发挥药效,如喜树碱(CPT)、紫杉醇(PTX)、多柔比星、表柔比星等,经修饰后的小分子药物理化性质会发生改变,可以解决水溶性差、半衰期短、靶向性差、毒性大等缺点,使许多受到限制的小分子药物有了新的发展前景。Wenhai Lin[9]等人成功合成了110 nm的稳定聚乙二醇化紫杉醇纳米粒子(PEG-PTX NP),在3D平台上研究PTX与PEG-PTX NP对鼻咽癌(NPC43)细胞行为的影响,结果显示,PEG-PTX NP的药物释放更加稳定,细胞毒性更弱。

2.3 PEG修饰技术在递药系统中的应用传统药物存在半衰期短、靶向性差、对人体组织有毒副作用等缺点。将药物分散在特殊的体系中,控制药物在体内释放的方式和速率以及地点,从而提高其疗效和安全性,这种药物制品被称为药物递送系统[10](drug delivery system,DDS),又称作新剂型或现代药物剂型。功能性高分子化合物的研究是药物递送系统研究中的重要方向。目前,PEG修饰递药系统已经在临床中获得应用,具有广阔的发展前景。

2.3.1 修饰纳米粒 纳米粒是将药物吸附、连接或包裹于载体材料而制成的一种新型给药系统,载体材料通常选择天然聚合物或人工合成的高分子材料,比如卵磷脂、玉米醇溶蛋白、白蛋白、聚乳酸、环糊精等[11]。修饰后的纳米粒经给药进入体内,不易被内皮网状组织(RES)识别并摄取,延长了体内循环时间,使药物集中在作用部位,改善药物的体内分布,减轻了对正常组织的损害。Ling Zhang等人[12]以壳聚糖为载体材料,进行PEG修饰并包载环孢霉素A,评价了其药代动力学和药效学。实验结果显示,纳米粒的生物半衰期是环孢霉素A溶液的21倍,PEG修饰大大延长了环孢霉素A在体内的循环时间,提高了其生物利用度。

2.3.2 修饰脂质体 脂质体是指将药物包封在磷脂双分子层、胆固醇等仿生膜结构中,对水溶性药物和脂溶性药物都有较好的负载效果。当脂质体作为药物载体时,具有淋巴系统趋向性,可被单核巨噬细胞摄取,并通过细胞内吞和融合作用,直接将药物送入细胞内,对肝、脾等组织具有靶向性[13];对脂质双分子层进行修饰,加入抗体、受体配体和糖残基可以使其主动靶向至作用部位;向其加入特殊脂质和磁性材料,可使药物物理靶向至作用部位。尿石素A(Uro-A)是哺乳动物肠道中鞣花单宁的代谢产物,具有抗氧化,抗炎和抗肿瘤作用。但是,Uro-A的水溶解度低,半衰期短,极大限制了其临床应用。Yi Shengfu等人[14]首次制备了负载Uro-A的聚乙二醇化脂质体(Uro-A-PEG-LPs),并对其理化性质和体外抗肿瘤效果进行了评价。结果表明,Uro-A-PEG-LPs的稳定性提高,可在4 ℃下长期稳定储存,半衰期是普通游离Uro-A水溶液的4.58倍,延长了体内循环时间,增强了抗肿瘤疗效。

2.3.3 修饰胶束 胶束是指两亲性的嵌段聚合物在水溶液中溶解并自组装形成的核-壳结构制剂,可以有效避免分解变性,延长在体内的循环时间,降低药物毒性。胶束的制备方式主要有物理包载、化学结合、增容法以及聚离子复合法,物理包载通常载药量低、稳定性差,而化学结合往往更加稳定。贾李瑛[15]等人键合伊替立康活性代谢物SN38与PEG得到PEG-SS(O)-SN38,使用薄膜分散法得到制成自组装胶束。结果显示,胶束具有一定的缓释效果,在模拟的生理条件下稳定性良好,与相同剂量的盐酸伊立替康注射液相比,自组装胶束对人胰腺癌(Capan-1)瘤裸小鼠具有明显的肿瘤抑制作用。

2.3.4 修饰树枝状聚合物 树枝状聚合物(Dendrimer)是一种具有高度枝化结构的大分子,合成方法主要有发散合成法、收敛合成法、发散收敛共用法和固相合成法。树枝状分子具有低粘度、内部空腔大、纳米级尺寸、结构精确可控、表面分布大量官能基团等特点,使其在生物医药、催化剂及光电功能材料等领域受到人们广泛的关注。使用PEG修饰树枝状分子作为药物载体,可以显著提高包封率、载药量以及稳定性,同时可以延长药物的血浆循环时间,降低药物对正常组织的毒性,减轻治疗过程中的副作用[16]。聚酰胺胺树枝状大分子(PAMAM)可以促进口服药物的吸收,但其结构上的胺基与细胞膜相互作用会导致细胞膜毒性,抑制了其在临床应用中的发展,高尧春[17]对PAMAM进行PEG修饰得到PAMAM-PEG聚合物,结果表明,PAMAM-PEG无明显毒性作用,可促进肠道吸收过程,提高化合物的口服生物利用度。

3 PEG面临的问题

3.1 过敏目前,在PEG临床应用中,过敏反应是常见的副反应之一,PEG在体内产生的副产物可能会引发不良反应,导致超敏反应(hypersensitivity reactions,HSR)的发生。Fionnuala Cox[18]报告了6例急性PEG超敏反应,因此,在PEG的临床使用中,需要对其进行早期识别,提高使用安全性。聚乙二醇(PEG)是新冠病毒疫苗中的辅料之一,辉瑞公司的新冠病毒疫苗发生过几起严重过敏事件,主要原因就是患者对PEG过敏。

3.2 加速血液清除(ABC)加速血液清除(ABC)现象是PEG的一种潜在免疫反应。一直以来,人们都认为PEG化脂质体没有免疫原性。但是,研究者们发现向同一动物体内重复注射PEG修饰的纳米制剂时,药代动力学会发生改变,这是因为多次注射诱导产生了PEG特异性的IgM抗体,重复注射的制剂会丧失其长循环特性,血液清除速度加快,在肝和脾的聚集量增加[19]。

3.3 不可生物降解性PEG的另一个缺点是它的不可生物降解性,高分子量缀合物的PEG修饰后的药物在体内停留时间增加,会导致药物在肝脏中积累,从而引起大分子综合征[2]。PEG在体内主要由肾脏清除,但是目前没有研究准确计算出肾脏可清除PEG的精确分子量。

3.4 不稳定性当PEG为固态和在溶液中加热时具有不稳定性,都会发生降解,经研究者试验,100 kDA的固体PEG在60 ℃的空气中放置一个月后,MW减少了10倍[20]。PEG被机械应力、氧气、水和能量等因素刺激后,还会发生化学反应导致PEG的降解。

3.5 阻碍药物摄取率在基因递送系统中,PEG修饰会中和递药系统表面的zeta电位,从而提高它的分散性和水溶性等性质并降低基因载体的毒性,但是PEG有时会起到阻挡的作用,降低基因递送载体的细胞摄取和转染效率,所以在一定程度上,PEG可能会阻碍药物摄取并降低其疗效。

3.6 汉族人体阳性率问题近年来有研究表明,PEG化脂质体会诱导抗-PEG抗体的产生,这种抗体会和PEG制剂结合,从而激活相关假变态反应(complement activation related pseudo allergy,CARPA),引起机体的免疫应答,患者临床表现为呼吸困难、胸痛、低血压或高血压以及心脏疼痛。而且据相关文献表明,健康汉族人血液内的抗-PEG抗体阳性检测率远高于其他种族[21]。

4 替代

4.1 聚甘油(PG)Michael Tully等人[22]选择用PG-蛋白偶联物修饰治疗性蛋白阿那白滞素(IL-1ra,Kineret)的N-末端,同时用分子量相同的PEG进行修饰设计对照实验,得到PEG-anakinra和PG-anakinra。两种缀合物的流体动力学性质和二级结构相差不大,对IL-1ra的结合亲和力都随着聚合物长度的增加而降低。与未修饰的蛋白质相比,40 kDa的PG-anakinra的半衰期延长了4倍,与PEG-anakinra的半衰期相同。研究结果表明,两种缀合物的性能相差不大,所以PG在药物半衰期延长方面具有较大的发展前景。

4.2 聚肌氨酸(PSar)Yali Hu等人[23]报道了一种非离子型亲水多肽聚肌氨酸(PSar),并使用其修饰人干扰素-α2b(IFN)的N-末端,将得到的PSar-IFN与PEG干扰素结合物(PEG-IFN)进行系统的比较。研究发现,与PEG-IFN相比,在体外,PSar-IFN的活性更强;在体内,PSar-IFN可以有效的抑制肿瘤生长,并且在小鼠体内引发更少的的抗IFN抗体,不会出现ABC现象。所以这种多肽在生物医学应用中具有巨大的潜力。

4.3 聚山梨酯80(PS80)阿斯利康新冠病毒疫苗中的赋形剂是聚山梨酯80(PS80),Priya Sellaturay等人[24]根据聚乙二醇和聚山梨酯的组成和皮肤试验数据,提出了聚乙二醇和聚山梨酯之间的交叉反应性。实验选中8例在剑桥大学医院过敏门诊确诊的PEG过敏患者,患者在接种疫苗前接受了PS80(20%)和阿斯利康COVID- 19疫苗的皮肤点刺试验。结果显示8例PEG过敏患者均耐受阿斯利康新冠病毒疫苗。结果表明,对PEG过敏的患者,可以安全接种阿斯利康含有PS80的疫苗。

5 展望

近年来,药品的PEG修饰技术发展十分迅速并取得了突破性进展,从实验室阶段走入产品开发及临床应用,国外许多PEG修饰的药品也不断上市,为人类对抗疾病提供强有力的手段。虽然PEG修饰技术仍然存在很多问题,但是PEG修饰仍然是改善药物药代动力学和药效学的首要选择。目前,研究者们仍很难找到可以完全取代PEG的替代品。PEG修饰技术在递药系统中仍发挥着不可或缺的重要作用,如何去除PEG化制剂的ABC现象是目前临床应用中的难点和研究热点,研究者们应该更全面的去了解纳米制剂清除系统,探讨如何防止或延缓纳米制剂的清除,减少ABC现象的发生,使PEG化在临床治疗获得更多突破性的进展。