体外模拟消化筛选抗消化降糖肽及降糖活性研究

韩 迪，苏 情，田晓闽，3，张学军，张西平，孙琳琳，龚魁杰，郭玉秋，刘开昌，陈利容

（1. 烟台大学，山东 烟台 264000；2. 山东省农业科学院 作物研究所，山东 济南 250100；3. 青岛农业大学，山东 青岛 266000；4. 山东天久生物技术有限公司，山东 菏泽 274108；5. 山东省农业科学院，山东 济南 250100）

高血糖是糖尿病的主要特征，长期的高血糖症状会引发眼病、心血管病、脑血管病等各种慢性并发症，严重者危及生命[1]。目前，包括阿卡波糖、二甲双胍在内的治疗T2DM 的6 类长效或短效药物都有一定的副作用，会对患者的身体造成不同程度的损害，且合成药物成本高、价格昂贵[2]。因此，具有良好降低血糖功效的天然产物受到了广泛关注。

生物活性肽是一类对生物机体的生命活动有益或具有生理作用的肽类化合物，其中具有降血糖功能的肽类多用于开发预防和治疗糖尿病或肥胖症的药物[3]。降糖肽一般是由2～15 个氨基酸残基组成的短肽，其降血糖能力也与降糖肽的含量及氨基酸组成有关[4]。降血糖原理主要分为2 种，一是驱动胰岛β 细胞分泌胰岛素，增强胰岛素敏感性；二是竞争性抑制α - 葡萄糖苷酶活性，阻断α-1,4 糖苷键水解，延缓淀粉在小肠分解为葡萄糖，抑制餐后血糖快速上升。

降糖肽通常通过口服的方式进入人体，在胃和肠道中进行消化吸收。有研究表明[5]，胃和肠道中的蛋白酶、pH 值等均会影响生物活性肽在人体胃肠道中的吸收与释放。冯晓文等人[6]通过体外模拟消化试验研究发现，消化后的乳清肽ORAC 值明显提高。王倩等人[7]则发现海地瓜多肽体外模拟消化后，降糖活性下降。目前，对模拟消化后降糖肽的生物活性研究，已经成为学者的研究热点。因此，经体外模拟消化方法，筛选获得具有高活性的降糖肽，并开展人体餐后血糖试验验证，为降糖肽产品开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

海洋鱼肽、螺旋藻肽、豌豆肽、牡蛎肽、大豆肽、小麦肽、乳清肽；胃蛋白酶，北京索莱宝科技有限公司提供；胰酶、DPP-IV 酶，美国Sigma 公司提供；α - 葡萄糖苷酶，上海源叶生物科技有限公司提供；对硝基苯-α-D- 葡萄糖苷（99%），上海麦克林生化科技有限公司提供，其余试剂均为分析纯。

SQP 型电子分析天平，上海赛多利斯产品；Sorvall ST 8R 型离心机，美国赛默飞产品；SHA-B型恒温振荡器，常州国华产品；DK-98-IIA 型电热恒温水浴锅，天津泰斯特产品；FE28 型pH 计，瑞士梅特勒- 托利多产品；Varioskan LUX 型酶标仪，美国赛默飞产品；Onetouch 血糖仪，深圳强生产品。

1.2 试验方法

1.2.1 消化前后降糖肽α - 葡萄糖苷酶抑制率测定

（1） 消化前降糖肽α - 葡萄糖苷酶抑制率测定。将样品用0.1 mol/L（pH 值6.8） 磷酸钾缓冲液（PBS） 配置成4 mg/mL 的溶液，在96 孔酶标板中加入样品液40 μL，1 U/mL α- 葡萄糖苷酶溶液20 μL，于37 ℃下保温10 min，再加入1×10-3mol/L 对硝基苯-α-D- 葡萄糖苷（PNPG） 溶液40 μL，于37 ℃下保温10 min，最后加入1 mol/L Na2CO3溶液100 μL 终止反应，于波长405 nm 处测定样品组吸光度（A样品），用PBS 代替PNPG 作为样品背景组（A样品背景），用PBS 代替样品作为空白组（A空白），用PBS 代替样品和PNPG 作为空白背景组（A空白背景） α - 葡萄糖苷酶抑制率计算见公式（1）：

（2） 消化后降糖肽的α - 葡萄糖苷酶抑制率测定。制备人工胃液：取240 mL HCl 溶液（pH 值2），胃蛋白酶（3 000～3 500 U/g） 1.8 g，摇匀后，加水稀释至300 mL，置于4 ℃冰箱备用。制备人工小肠液：取磷酸二氢钾2 g，加水150 mL 使其溶解，用0.1 mol/L NaOH 溶液调节pH 值至6.8，取胰酶3 g，加水适量使溶解，将以上配制的溶液混合后，加水稀释至300 mL，置于4 ℃冰箱中备用。

以人工胃液和肠液为溶剂，添加样品质量浓度控制为4 mg/mL。取1 mg 样品，加入20 mL 人工胃液，温度37 ℃，转速100 r/min 震荡2 h 后，pH 值调至6.8，移入20 mL 人工小肠液摇匀，温度37 ℃，转速100 r/min 振荡3 h，最后85 ℃灭酶10 min，降至室温后进行超滤离心处理，保留滤出液，根据1.2.1（1） 方法测定消化后降糖肽的α- 葡萄糖苷酶抑制率。

1.2.2 降糖肽抗氧化活性的测定

（1） 降糖肽羟基自由基清除率测定。参考庞忠莉[8]的方法，将样品配制成溶液，稀释至0.2，1.0，5.0，10.0，20.0 mg/mL 的梯度溶液，向其中分别加入0.009 mol/L 的FeSO4溶液1 mL，0.009 mol/L 的水杨酸- 乙醇溶液（50%乙醇溶液） 1 mL，用漩涡振荡器混合均匀，加入H2O2（0.03%） 溶液1 mL 启动反应。将混合液置于37 ℃恒温水浴锅中反应30 min，若有沉淀产生，以转速5 000 r/min 离心5 min，上清液于波长510 nm 处测得样品吸光度（A1），用1 mL蒸馏水代替样品，其他条件不变作为对照组（A2），用50%乙醇代替水杨酸- 乙醇溶液1 mL，其他条件不变作为空白组（A0），羟基自由基的清除率计算见公式（2）：

计算羟基自由基清除率半数抑制浓度IC50。

（2） 降糖肽DPPH 自由基清除率测定。参考冯晓文等人[6]的方法。将活性肽分别配置成1，2，5，10，20 mg/mL 的溶液，取0.2 mmol/L DPPH（95%乙醇溶解） 0.5 mL 与降糖肽溶液0.5 mL，混匀，避光反应30 min，于波长517 nm 处测定样品吸光度（A样品），同时以95 %乙醇加样品作空白组（A空白），DPPH 溶液加上95%乙醇为对照组（A对照），DPPH自由基清除率计算见公式（3）：

计算DPPH 自由基清除率半数抑制浓度IC50。

（3） 降糖肽总还原能力测定。参考赵红星[9]的方法，取1 mL 不同浓度的样品溶液（1，2，5，10，20 mg/mL），与0.2 mol/L 磷酸钠缓冲液2.5 mL（pH=6.6） 和1% （W/V） 铁氰化钾水溶液2.5 mL 混合，50 ℃保温30 min，迅速冷却，再加入10% （V/V）的三氯乙酸水溶液2.5 mL，以转速3 000 r/min 离心10 min，取2.5 mL 上清液，加蒸馏水2.5 mL 和0.1%（W/V） 的氯化铁水溶液0.5 mL，混合均匀。反应10 min 后于波长700 nm 处测吸光度，用吸光值大小代表总还原能力。

1.2.3 降糖肽对餐后血糖浓度的影响测定

选取男女各5 名空腹血糖和糖耐量正常，无代谢性疾病，消化系统疾病，内分泌系统疾病及家族糖尿病史，身体健康，近期内未服用可能影响糖代谢药物的成年人，平均年龄在25.17±1.17 岁，所有研究对象年龄、性别差异均无统计学意义（p＞0.05），被试者在试验前均已签署知情同意书。测定试验对象餐后240 min 内血糖浓度变化。

GI 测定按照WS/T 652—2019《食物血糖生成指数测定方法》：Wolever 法。

2 结果与分析

2.1 消化前后降糖肽的α - 葡萄糖苷酶抑制率

消化前后降糖肽的α- 葡萄糖苷酶抑制率见图1。

图1 消化前后降糖肽的α - 葡萄糖苷酶抑制率

由图1 可知，未经过体外模拟消化的蛋白短肽的α - 葡萄糖苷酶抑制率差异不大，均在31.5%以下，但是经体外模拟消化后的不同降糖肽的α - 葡萄糖苷酶抑制率均发生不同程度的变化，其中豌豆肽、小麦肽、大豆肽、牡蛎肽、乳清肽的α - 葡萄糖苷酶抑制率较消化前高，且牡蛎肽和乳清肽的增加为原来的2.5 倍，分别为72.09%和69.91%。根据张廷新等人[10]的研究，降糖肽的生物活性主要取决于其含量和氨基酸序列组成，因此，降糖肽体外消化前后α - 葡萄糖苷酶抑制率变化有2 种原因：第1 种是由于体外消化酶对不同降糖肽的水解程度不同导致的，根据Yao R 等人[11]研究，生物活性肽对α -葡萄糖苷酶的抑制活性在一定范围内随水解度增加而增加；第2 种是由于酶解后降糖短肽的氨基酸组成不同导致的，根据Hatanaka T 等人[12]的研究，通过切割不同部位的肽键，产生不同氨基酸组成的二肽基肽酶抑制肽，对二肽基肽酶抑制率的IC50值相差11 倍以上。结果表明，牡蛎肽和乳清肽最适合用作人体降糖肽。

2.2 降糖肽的抗氧化活性

降糖肽的抗氧化活性见图2。

图2 降糖肽的抗氧化活性

由图2（a） 可知，乳清肽和牡蛎肽的羟基自由基清除率都随样品浓度增加而增强，乳清肽和牡蛎肽的羟基自由基清除率IC50值分别为5.40，7.32 mg/mL，与庞忠莉[8]的研究一致。因此，乳清肽和牡蛎肽对于羟自由基具有良好的清除效果。由图2（b） 可知，乳清肽和牡蛎肽的DPPH 自由基清除率都随样品质量浓度增加而增强，乳清肽质量浓度为10 mg/mL 时和乳清肽质量浓度为20 mg/mL 时，DPPH 自由基清除率超过90%，IC50值分别为6.66，2.53 mg/mL，与冯晓文等人[6]的研究一致。因此，乳清肽和牡蛎肽对于DPPH 自由基具有良好的清除效果。由图2（c）可知，乳清肽和牡蛎肽在一定质量浓度范围内，A700显示的吸光度与质量浓度呈线性正相关性，即总还原能力随着质量浓度的增加而升高[9]，当乳清肽和牡蛎肽质量浓度达到20 mg/mL 时，A700值接近于0.4，均显示出较高的还原能力。结果表明，乳清肽和牡蛎肽均具有良好的抗氧化性。

2.3 降糖肽对人体餐后血糖浓度的影响

降糖肽对人体餐后血糖浓度的影响见图3。

图3 降糖肽对人体餐后血糖浓度的影响

由图3 可知，人体餐后血糖浓度呈现先增加后降低趋势，进食120 min 之后血糖浓度基本趋于稳定，进食馒头后再服用乳清肽和牡蛎肽，血糖浓度增加速率变缓，另外，进食馒头血糖浓度峰值在进食后30 min，为9.13±0.15 mmol/L，在服用乳清肽和牡蛎肽后，血糖浓度峰值延后，为进食后45 min，分别为8.23±0.15 mmol/L 和8.63±0.15 mmol/L，且乳清肽组血糖浓度峰值低于牡蛎肽。根据2.1 结果，乳清肽和牡蛎肽被人体消化后，仍能够有效抑制α -葡萄糖苷酶活性，抑制淀粉在小肠分解为葡萄糖，从而降低餐后血糖浓度升高速率。有研究表明，降低血糖浓度的另一个途径是，通过刺激胰岛素分泌来增加葡萄糖消化。因此，图3 中服用乳清肽后血糖浓度峰值低于牡蛎肽，可能是乳清肽对胰岛素产生的促进作用高于牡蛎肽。

根据人体餐后血糖浓度变化结果，以葡萄糖GI值为参照，计算馒头GI 值为79.09，食用馒头后，再分别食用乳清肽或牡蛎肽，测得馒头的GI 值分别为63.14 和67.44，分别降低为馒头本身GI 值的79.83%和85.26%，降糖效果明显。因此，乳清肽和牡蛎肽均能减少人体餐后血糖上升，适合用作人体降糖肽。

3 结论

对豌豆肽、螺旋藻肽、海洋鱼肽、小麦肽、大豆肽、牡蛎肽和乳清肽7 种降糖肽进行体外模拟消化筛选，α - 葡萄糖苷酶抑制率试验筛选出牡蛎肽和乳清肽是适合用作人体食用的降糖肽，羟基自由基清除率、DPPH 自由基清除率和总还原能力结果得出乳清肽和牡蛎肽具有良好的抗氧化活性，人体餐后血糖浓度变化和GI 值结果得出，牡蛎肽和乳清肽均能够明显降低人体餐后血糖水平。